不同N-乙酰-5-羟色胺(NAS)给药途径对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤的影响△

徐宁 殷慧文 张宁 刘建晓 王晓莉 赵岩松

视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)可见于多种眼部疾病，如视网膜血管闭塞、糖尿病视网膜病变和青光眼等[1]，是目前致盲的主要原因之一。N-乙酰-5-羟色胺(N-acetylserotonin,NAS)属于吲哚类激素，是一种天然存在的化学中间体，是褪黑素的前体物质。有研究表明，NAS对缺血性疾病和神经系统疾病模型均具有神经保护作用[2]。本课题组前期研究亦发现，NAS可通过抑制活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Fas/FasL、Bax蛋白的表达和促进Bcl-2蛋白的表达而减轻RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡[3-4]，进一步证明NAS对RIRI的神经有保护作用。鉴于不同的给药途径疗效不同，本研究采用升高眼压法建立RIRI模型，探讨腹腔与静脉注射两种不同NAS给药途径对RIRI大鼠视网膜形态结构、活性Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响，以期为NAS治疗RIRI的临床最佳给药途径提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组健康无眼疾成年Sprague-Dawley雄性大鼠54只，体质量200～250 g。经裂隙灯检查大鼠的眼前节及后节均无异常，随机分为正常对照组(n=6)、RIRI腹腔组(n=12)、RIRI静脉组(n=12)、NAS腹腔组(n=12)和NAS静脉组(n=12)。正常对照组不作处理，后四组建立RIRI模型。NAS腹腔组和NAS静脉组于建模前30 min分别经腹腔、尾静脉按10 mg·kg-1体质量注射NAS，RIRI腹腔组和RIRI静脉组于造模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射同等剂量的生理盐水。RIRI腹腔组、RIRI 静脉组、NAS腹腔组及NAS静脉组依据RIRI后时间分为24 h及7 d两个亚组(n=6)。实验动物及实验使用条件均符合《实验动物管理条例》的规定。

1.1.2 主要试剂及仪器NAS(美国Sigma-Aldrich公司)，兔抗活性Caspase-3抗体、兔抗二步法试剂盒、DAB显色剂试剂盒、HE染色试剂盒(中国Servicebio公司)，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)。电子分析天平(AL-204，美国Mettler Toledo公司)，石蜡切片机(Shandon Finesse325，英国珊顿公司)，正置荧光显微镜(BX-51，日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 RIRI模型制作采用前房加压灌注升高眼压法制作RIRI动物模型。100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉，统一选取各组大鼠右眼，复方托吡卡胺散瞳，盐酸奥布卡因表面麻醉，微量注射器自大鼠右眼颞侧角膜缘刺入前房并固定，升高输液瓶高度使眼内形成110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)的眼压，此时可见大鼠前房加深，球结膜苍白，直接检眼镜见眼底视网膜血管白线，血流中断；持续灌注60 min后缓慢降低输液瓶高度至眼平面水平，恢复正常眼压，此时可见大鼠眼球色红，眼底血管清晰，提示RIRI模型建立成功。

1.2.2 标本的采集及石蜡切片的制作分别于RIRI后24 h、7 d，各组分别随机取大鼠右侧眼球6只，40 g·L-1多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明后浸蜡包埋。沿视神经矢状轴作非连续切片，切片厚度约为4 μm。RIRI后24 h，各组视网膜组织行免疫组织化学染色和TUNEL染色；RIRI后7 d，各组视网膜组织行HE染色。

1.2.3 HE染色石蜡切片脱蜡至水，苏木素染核，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜观察并拍照。采用Cellsens 1.6图像分析软件，随机选取4点测量大鼠视网膜距视盘外200 μm 处100 μm长度内的内界膜到外丛状层内层内缘厚度，取均值作为视网膜内层厚度，并计算距视盘边缘100 μm处100 μm长度内视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell，RGC)层单位面积RGC数。

1.2.4 免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡水化，抗原修复，体积分数3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，加入兔抗活性Caspase-3(175)4 ℃ 冰箱过夜；复温后使用0.01 mol·L-1PBS冲洗，加入兔抗大鼠多克隆抗体，DAB显色，苏木素染核，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察并计算单位面积活性Caspase-3染色阳性细胞数。

1.2.5 TUNEL染色检测大鼠视网膜细胞凋亡按照TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木素染核，脱水、透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。每只大鼠取4～5张非连续切片，每张切片随机选取10个400倍视野，计算单位面积 TUNEL染色阳性细胞数。

2 结果

2.1 HE染色结果光学显微镜下观察可见，正常对照组大鼠视网膜各层分界清楚，视网膜细胞形态正常，细胞排列紧密、规整。RIRI后7 d，与正常对照组相比，RIRI腹腔组和RIRI静脉组视网膜层次可，各层组织形态欠规则，细胞排列疏松、紊乱；视网膜内层厚度明显变薄，RGC数目明显减少，与正常对照组相比差异均具有统计学意义(均为P<0.05)；RIRI腹腔组与RIRI静脉组间视网膜内层厚度、RGC数目比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。RIRI后7 d，NAS腹腔组视网膜层次较清晰，各层组织形态较规则，细胞排列较规整；NAS静脉组视网膜各层形态及细胞排列均趋于正常。NAS腹腔组、NAS静脉组较RIRI腹腔组和RIRI静脉组大鼠视网膜内层变薄程度及RGC数目减少程度均减轻，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)，且NAS静脉组变化程度均较NAS腹腔组更明显，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)；但NAS静脉组、NAS腹腔组视网膜内层厚度、RGC数目与正常对照组相比差异仍均有统计学意义(均为P<0.05)。见图1、表1。

图1 RIRI后7 d，各组大鼠视网膜HE染色结果(×400) A：正常对照组，视网膜各层分界清楚，视网膜细胞形态正常，细胞排列紧密、规整；B、C： RIRI腹腔组和RIRI静脉组，视网膜层次可，各层组织形态欠规则，细胞排列疏松、紊乱；D：NAS腹腔组，视网膜层次较清晰，各层组织形态较规则，细胞排列较规整；E：NAS静脉组，视网膜各层形态及细胞排列均趋于正常

组别视网膜内层厚度/μm RGC数/个·mm-2Caspase-3阳性细胞数/个·mm-2TUNEL染色阳性细胞数/个·mm-2正常对照组96.71±1.41721.07±45.9175.92±14.79644.18±75.90RIRI腹腔组82.37±1.09a390.72±72.12a387.79±26.72a2140.53±177.96aRIRI静脉组82.81±0.90a434.42±87.17a380.54±41.25a2122.77±165.76aNAS腹腔组87.80±1.33ab529.25±92.05ab221.34±30.84ab1968.96±254.98abNAS静脉组91.67±1.43abc616.90±79.51abc145.01±22.54abc1468.03±128.40abcF值868.28046.510531.830304.050P值0.0000.0000.0000.000

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与RIRI腹腔组、RIRI静脉组比较，bP<0.05；与NAS腹腔组比较，cP<0.05

2.2 活性Csapase-3免疫组织化学染色结果活性Csapase-3蛋白阳性表达为细胞核棕黄色染色，主要见于RGC层和内核层。正常对照组视网膜偶见活性Caspase-3阳性细胞。RIRI后24 h，RIRI腹腔组和RIRI静脉组视网膜可见大量的活性Caspase-3阳性细胞，与正常对照组相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05),但2组间活性Caspase-3阳性细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)；NAS腹腔组、NAS静脉组活性Caspase-3阳性细胞数较RIRI腹腔组和RIRI静脉组均减少，且NAS静脉组活性Caspase-3阳性数显著低于NAS腹腔组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；但NAS腹腔组、NAS静脉组活性Caspase阳性细胞数仍均高于正常对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图2、表1。

图2 RIRI后24 h，各组大鼠视网膜活性Caspase-3蛋白免疫组织化学染色结果(×400) A：正常对照组，几乎未见活性Caspase-3阳性细胞；B、C： RIRI腹腔组和RIRI静脉组，可见大量活性Caspase-3阳性细胞；D、E：NAS腹腔组和NAS静脉组，可见较少活性Caspase-3阳性细胞。箭头示活性Caspase-3阳性细胞

2.3 TUNEL染色结果大鼠视网膜TUNEL染色阳性细胞表现为细胞核呈棕色，主要位于RGC层和内核层。正常对照组大鼠视网膜偶见TUNEL染色阳性细胞。RIRI后24 h，与正常对照组相比，RIRI腹腔组、RIR静脉组、NAS腹腔组、NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数均明显增加，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；RIRI腹腔组与RIRI静脉组间TUNEL染色阳性细胞数比较，差异无统计学意义(P>0.05);与RIRI腹腔组和RIRI静脉组相比，NAS腹腔组、NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数均明显降低，差异均具有统计学意义(均为P<0.05)；与NAS腹腔组相比，NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数降低更明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3、表1。

图3 RIRI后24 h，各组大鼠视网膜TUNEL染色结果(×400) A：正常对照组，偶见TUNEL染色阳性细胞；B、C： RIRI腹腔组和RIRI静脉组，可见大量TUNEL染色阳性细胞；D、E：NAS腹腔组和NAS静脉组，可见较少TUNEL染色阳性细胞。箭头示TUNEL染色阳性细胞

3 讨论

近年来关于RIRI的研究越来越多，特别是各种药物的治疗效果，然而目前对RIRI仍缺乏行之有效的治疗方案，RIRI的预防与治疗已成为目前眼科学研究的热点问题。NAS作为褪黑素的前体物质，经芳香胺-N-乙酰转移酶(AANAT)催化后由5-羟色胺合成，其主要表达于松果腺和视网膜中，NAS不仅在眼部疾病，在神经系统、消化系统及生殖系统等疾病上的研究也取得了很多的成就[5-7]。NAS在RIRI中主要通过抗细胞凋亡、拮抗氧自由基、干预炎症反应等途径对神经保护起着重要作用[8]。张婷婷等[3]研究表明，NAS腹腔注射可抑制RIRI后的视网膜细胞凋亡，具有神经保护作用。然而迄今为止，尚未见有研究比较不同NAS给药途径对RIRI的影响，而静脉注射可极大程度提高血药浓度，故本研究拟通过组织病理学、免疫组织化学染色和TUNEL染色法比较腹腔注射与尾静脉注射两种途径对RIRI的保护作用。

研究发现，RIRI后7 d，大鼠视网膜形态开始出现较明显的渐进性损伤，包括视网膜厚度变薄、RGC损害等[9]，故本研究选取RIRI后7 d对大鼠视网膜行HE染色，观察腹腔和静脉注射两种给药途径的NAS对RIRI大鼠视网膜组织病理形态学的影响。结果显示，RIRI后7 d，RIRI静脉组和RIRI腹腔组大鼠视网膜层次可，各层组织形态欠规则，细胞排列疏松、紊乱，视网膜内层厚度变薄、RGC数目均明显减少；NAS腹腔组、NAS静脉组大鼠视网膜层次较清晰，各层组织形态较规则，细胞排列较规整，视网膜内层厚度变薄程度、RGC数目减少程度均较RIRI静脉组和腹腔组明显减轻，且NAS静脉组大鼠各层视网膜组织形态结构、视网膜内层厚度和RGC数目均趋于正常。其中，RIRI后视网膜细胞的减少主要出现在内5层，尤其是RGC层和内核层，其中包含的主要细胞为RGC、无长突细胞、双极细胞和水平细胞，这与文献报道是一致的[10]。提示NAS静脉治疗途径能更好地减轻RIRI大鼠视网膜的病理学损伤，这可能是由于静脉注射给药可使药物直接进入血液循环，起效快，损耗小，而腹腔注射则要经过首关消除，因此会导致药物的大量损耗；另外，也可能由于静脉注射的吸收速度比腹腔注射快得多，因而静脉注射更容易达到更高的血药浓度，从而产生更强烈的反应。

细胞凋亡在RIRI中的重要作用日益凸显，是心、脑、肠及视网膜等组织RIRI中细胞死亡的主要形式。凌士奇等[11]通过实验证实，RIRI大鼠视网膜内层细胞的凋亡征象尤以再灌注24 h时最为显著，而Caspase是细胞凋亡过程中尤为重要的蛋白酶，凋亡最后的实施是靠Caspase的激活而实现的，Caspase的激活是一种“瀑布式”的级联反应，而Caspase-3是Caspase级联反应中下行的最关键的执行蛋白酶，在各种凋亡程序中起最后枢纽的作用[12]。因此，本研究通过对RIRI后24 h的活性Caspase-3阳性细胞数及TUNEL染色阳性细胞数的观察，探讨NAS腹腔和静脉注射两种给药途径对RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的影响。结果显示，NAS腹腔组、NAS静脉组在RIRI后24 h活性Caspase-3蛋白的表达和TUNEL染色阳性细胞数均少于RIRI腹腔组和RIRI静脉组，且NAS静脉组活性Caspase-3蛋白的表达和TUNEL染色阳性细胞数均少于NAS腹腔注射组。提示腹腔与静脉注射NAS均可不同程度地减轻RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡，发挥神经保护作用，且NAS静脉注射的疗效优于NAS腹腔注射。

总之，静脉与腹腔注射NAS均可减少RIRI后视网膜细胞的凋亡，从而减轻RIRI大鼠视网膜损伤，且静脉给药较腹腔给药疗效更为显著。本研究为NAS治疗RIRI的最佳途径选择提供了一定的理论依据。