雌二醇通过激活SIRT1/P53通路对人晶状体上皮细胞抗凋亡作用研究△

潘家钰 康刚劲 徐曼华 彭正虹 申苑莎

年龄相关性白内障(age related cataract,ARC)已经成为中老年群体视力损伤的常见疾病，据报道，ARC的发病与人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)的氧化损伤和细胞凋亡有关。早期已有研究者发现白内障的发病率在不同性别患者中存在着显著差异[1]，一定浓度的雌激素能有效抑制HLECs凋亡并发挥其抗氧化功能[2]。

Sirtuins是一种高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸家族-依赖性组蛋白去乙酰化酶，而沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是该家族中的成员之一,它被视为多种生物寿命的“调控因子”[3]。SIRT1的上调已被证明对各种眼部疾病，如白内障、视网膜变性、视神经炎和葡萄膜炎，具有重要的保护作用[4]，它主要通过底物组蛋白/非组蛋白的去乙酰化发挥作用[5]。目前，雌激素作用于HLECs的抗凋亡机制尚无定论，其是否通过影响SIRT1/P53(肿瘤抑制蛋白)通路来实现抗凋亡作用在HLECs中的报道尚少。本研究通过H2O2诱导HLE-B3细胞氧化损伤，探讨生理浓度下雌二醇(estradiol,E2)对HLE-B3细胞的作用机制，为进一步防治ARC的发生发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料HLE-B3细胞系(ATCC，美国)，E2粉末、H2O2试剂(Sigma，美国)，DMEM高糖培养基(HyClone，美国)，胎牛血清、CCK-8试剂盒(Dojindo,中国)，AnnexinV FITC/PI流式细胞检测试剂盒(BD公司，美国)，RNA提取试剂盒(Tiangen，中国)，BCA法蛋白定量试剂盒(上海碧云天公司)，PCR试剂盒(Qiagen，德国)，SIRT1、P53、乙酰化P53(acetylate P53，Ac-P53)、GAPDH抗体(Abcam，英国)。

1.2 方法

1.2.1 HLE-B3细胞的复苏与培养将保存于-80 ℃冰箱中的HLE-B3细胞取出，立即放于37 ℃温水浴中，待完全融化后离心取细胞悬液，置于含体积分数5%CO2培养箱进行培养，按13比例进行传代，每3 d传代一次。待细胞生长稳定后，计数铺板，根据实验条件加入相应试剂进行实验。

1.2.2 HLE-B3氧化损伤模型中鉴定H2O2最佳浓度取生长状态良好的HLE-B3细胞，待其生长至75%～80%，弃原有培养基，加入胰蛋白酶消化后重悬，进行细胞计数。每孔细胞取500×103个，每组设置3个复孔，待细胞贴壁，分别加入不同浓度(50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1)H2O2，CCK-8试剂盒测量每组细胞增殖率，流式细胞学检测每组细胞凋亡率。

1.2.3 实验分组将HLE-B3细胞接种于6孔板中，每孔细胞数量约500×103个，并随机分成5组，空白对照组：含胎牛血清的DMEM改良式培养基培养HLE-B3细胞；模型组：予以含100 μmol·L-1H2O2的培养基作用细胞12 h；低、中、高浓度E2组：分别予以0.01 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、1.00 μmol·L-1E2处理后，再加入含100 μmol·L-1H2O2的培养基，放入含体积分数5%CO2、37 ℃的恒温培养箱中培养(分组依据参考文献[6])。

1.2.4 CCK-8试剂盒检测细胞活力于96孔板中接种HLE-B3细胞，每孔10×103个，根据实验分组条件培养24 h，每组设置3个复孔，每孔加入CCK-8试剂10 μL，作用1.5 h，置于分光光度仪中设置波长为450 nm，测定每孔的吸光度(A)值，根据细胞活力=A处理组/A样品对照组×100%，计算各组细胞活力。

1.2.5 流式细胞学检测细胞凋亡率将HLE-B3细胞接种于6孔板中 ，每孔调整细胞个数约10×106个，重悬细胞，将细胞悬液移至离心管内，1500 r·min-1离心10 min，弃上清液，加入Loading buffer悬浮细胞，调整每组细胞数为200×103个 ，按照AnnexinV FITC/PI流式细胞检测试剂盒说明书进行检测。

1.2.6 RT-qPCR检测各组SIRT1 mRNA、P53 mRNA表达用Trizol裂解液裂解细胞后，按照RNA试剂盒提取细胞总RNA，于65 ℃水浴箱中变性5 min，将RNA逆转录为cDNA，选取GAPDH基因为内参基因进行RT-qPCR检测。SIRT1上游引物：TAGACACGCTGGAACAGGTTG，下游引物：GGTTTCATGATAGCAAGCGG；P53上游引物：GCGCACAGAGGAAGAGAATCT，下游引物：TATGGCGGGAGGTAGACTGAC。扩增条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，40个循环。记录每组目的基因和内参基因的CT值，相对表达定量(relative quantity,RQ)=2-△△Ct，结果以RQ统计。

1.2.7 Western blot检测SIRT1、P53、Ac-P53蛋白的表达RIPA裂解液裂解细胞，置于低温离心机中，12 000 r·min-1离心5 min,取上清。用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量检测，每组加入40 μg 总蛋白进行电泳，转膜，封闭液室温孵育1 h；充分洗涤后加入一抗稀释液4 ℃孵育过夜后磷酸盐缓冲液(PBS)洗膜，加入二抗稀释液，室温孵育30 min,PBS洗涤。结果用AlphaEaseFC软件处理系统分析目标条带的灰度值/GAPDH灰度值(灰度比)。

1.2.8 共聚焦免疫荧光染色于超净台中将细胞悬液转移至盖玻片上，培养6 h，PBS洗涤3次，每次5 min;40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，加入SIRT1一抗于4 ℃孵育过夜，再用PBS洗涤3次；待干后加入二抗室温孵育50 min，PBS洗涤，加入抗荧光淬灭剂，封片，共聚焦荧光显微镜观察。

2 结果

2.1 光学显微镜下观察HLE-B3细胞形态HLE-B3培养24 h后，显微镜下观察各组细胞形态。空白对照组(图1A)细胞贴壁生长，呈长梭形、不规则椭圆形。模型组(图1B)较空白对照组细胞密度降低，且可见部分细胞出现形态改变，胞体拉长变形，边界不清。低、中、高浓度E2组细胞的密度(图1C、图1D、图1E)均高于模型组，且随E2浓度梯度增加，HLE-B3细胞生长状态呈上升趋势。

图1 光学显微镜观察各组HLE-B3细胞形态的变化 A：空白对照组；B：模型组；C：低浓度E2组；D：中浓度E2组；E：高浓度E2组

2.2 E2对HLE-B3细胞生长活力的影响模型组的细胞增殖率(63.61%)较空白对照组(100.0%)明显降低(P<0.05)。低浓度E2组(75.78%)、中浓度E2组(82.30%)、高浓度E2组(98.40%)的细胞增殖率均高于模型组(均为P<0.05)。低浓度E2组<中浓度E2组<高浓度E2组(均为P<0.05)。

2.3 E2对HLE-B3细胞的抗凋亡作用流式细胞学检测各组细胞的凋亡率，空白对照组的HLE-B3凋亡率(3.86±0.04)%低于模型组细胞凋亡率(15.64±1.18)%(P<0.05)。低、中、高浓度E2组细胞凋亡率依次为(9.79±0.25)%、(8.88±0.14)%、(6.00±0.47)%。细胞凋亡率比较显示，模型组>低浓度E2组>中浓度E2组>高浓度E2组>空白对照组(均为P<0.05)。

2.4 E2对HLE-B3细胞SIRT1 mRNA、P53 mRNA表达的影响RT-qPCR检测各组HLE-B3细胞中SIRT1、P53mRNA的表达，模型组细胞中SIRT1 mRNA(RQ)(2.24±0.05)表达较空白对照组(1.01±0.02)明显升高(P<0.05)，SIRT1 mRNA表达水平模型组(2.24±0.05)<低浓度E2组(2.58±0.11)<中浓度E2组(3.7±0.13)<高浓度E2组(3.88±0.12)(均为P<0.05)。空白对照组P53 mRNA(RQ)(1.02±0.04)表达明显低于其他各组(均为P<0.05)，模型组(1.73±0.1)、低浓度E2组(1.82±0.16)、中浓度E2组(1.76±0.12)、高浓度E2组(1.74±0.14)组间P53 mRNA表达水平两两比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

2.5 Western blot检测细胞中SIRT1、P53、Ac-P53蛋白表达

2.5.1 Western blot检测E2对HLE-B3细胞中SIRT1蛋白表达的影响SIRT1蛋白表达(灰度比)在空白对照组(0.040)中呈现弱阳性，SIRT1蛋白表达组间比较：空白对照组<模型组(0.138)<低浓度E2组(0.250)<中浓度E2组(0.486)<高浓度E2组(0.712)(均为P<0.05)。

2.5.2 Western blot检测Ac-P53蛋白表达Ac-P53(灰度比)空白对照组(0.071)表达与高浓度E2组(0.070)差异无统计学意义(P>0.05)。Ac-P53表达比较：模型组(0.564)>低浓度E2组(0.317)>中浓度E2组(0.129)>高浓度E2组(均为P<0.05)。

2.5.3 Western blot检测E2对HLE-B3细胞中P53蛋白表达的影响P53(灰度比)在空白对照组(0.394)表达低于模型组(0.705)和其他各组(均为P<0.05)，组间P53表达两两比较结果显示，模型组与各浓度E2组(低浓度E2组灰度比0.718，中浓度E2组灰度比0.710，高浓度E2组灰度比0.705)差异均无统计学意义(均为P>0.05)。见图2。

图2 Western blot检测各组HLE-B3细胞SIRT1、Ac-P53、P53蛋白表达情况 A：空白对照组；B：模型组；C：低浓度E2组；D：中浓度E2组；E：高浓度E2组

2.6 免疫荧光染色检测SIRT1表达与定位共聚焦显微镜下观察E2对HLE-B3细胞中SIRT1免疫荧光的影响，特异性抗体与SIRT1结合后，在荧光显微镜下观察可呈现绿色荧光(见图3)，荧光染色着染细胞核，SIRT1分布于HLE-B3细胞的细胞核上，空白对照组(429.30±80.66)荧光强度较模型组(1776.53±285.48)弱(P<0.05)；组间两两比较，模型组<低浓度E2组(2541.10±489.43)<中浓度E2组(3400.25±645.86)<高浓度E2组(8442.82±1059.35)(均为P<0.05)。

图3 免疫荧光检测各组HLE-B3细胞SIRT1表达(×600) A：空白对照组；B：模型组；C：低浓度E2组；D：中浓度E2组；E：高浓度E2组

3 讨论

据预测，至2050年发达国家和发展中国家65岁及以上人口比例将会持续上升，随着预期寿命的增加，衰老的慢性疾病将会越来越普遍[7]。目前白内障仍是全球首位致盲性眼病，也是中老年群体视力损伤的常见疾病。ARC是白内障中最常见的类型，它易引起致盲与视觉功能障碍，其中HLECs在维持晶状体透明中起重要作用。本研究予以不同浓度的H2O2作用于HLE-B3细胞模拟HLECs氧化损伤，CCK-8和流式细胞学检测选出H2O2体外造模最佳浓度为100 μmol·L-1，作用时间为12 h。Wang等[8]用不同浓度H2O2作用于LECs 24 h，浓度在75 μmol·L-1以下时HLE-B3细胞活力轻微下降，浓度高于75 μmol·L-1时细胞存活率急剧下降，与本研究H2O2最佳浓度不一致，这可能与不同检测方法和细胞培养条件相关。

已有研究者调查发现，月经初潮年龄越早、绝经年龄越大、绝经后使用雌激素替代疗法的人群，白内障发病的风险会越低[9]。目前，研究雌激素对HLECs的保护作用主要通过抗氧化损伤和减少细胞凋亡来实现。Skiljic等[10]通过雌激素作用体外培养HLECs验证了雌激素通过非基因组机制介导抗氧化应激作用。Ganatra等[11]研究表明，雌激素可抑制山羊LECs骨架蛋白的解聚和细胞凋亡。王杰等[12]用不同浓度的E2作用体外培养的HLECs，表明E2通过上调HLECs中的端粒酶活性而抑制细胞凋亡。Roy等[13]研究表明，雌激素具有双相效应，不同浓度的雌激素对HLECs的作用不尽相同，国内外对其作用机制也尚无定论。本研究参照文献[6]将E2浓度组设置为生理状态下的浓度梯度(0.01 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、1.00 μmol·L-1)，探讨不同浓度E2对HLECs保护作用及其作用机制。

SIRT1是依赖性组蛋白去乙酰化酶，也是Sirtuins家族中的成员之一，有助于调节多种生物的寿命。SIRT1具有去乙酰化酶的作用，可以调节许多转录因子，如P53，叉头形蛋白O，转录因子E2F1，核因子κB，过氧化物酶体增殖物受体辅助激活因子1，成肌分化抗原等[14]。有研究表明在癌细胞中，SIRT1过表达可以阻断细胞的凋亡和衰老，并促进细胞增殖和血管的生成[15]，体外培养乳腺癌细胞发现E2通过雌激素受体α转录复合物直接影响促进SIRT1表达[16]。眼部组织中，SIRT1定位于角膜、晶状体、虹膜、睫状体和视网膜在内的组织细胞的细胞核、细胞质中[4]，氧化应激条件下，视网膜色素上皮细胞中也存在SIRT1表达增加及其抗氧化作用[17]。本研究通过共聚焦免疫荧光化学检测发现SIRT1多定位于HLEC细胞核上，且随着E2浓度的增加，SIRT1蛋白表达逐渐增加。P53是一种触发细胞凋亡的蛋白质，泛素化、磷酸化和乙酰化是P53的翻译后修饰，它对P53的稳定性及活性有重要的影响[18]。乙酰化的P53促进细胞凋亡，它已被证明是SIRT1的下游靶点[19]。本研究发现，随着E2浓度增加，SIRT1表达增加，Ac-P53减少，表明E2在某种程度上促进了SIRT1表达，其发挥去乙酰化作用，抑制P53乙酰化，阻止P53依赖性的凋亡通路，使细胞免于凋亡，并且在一定范围内随着E2浓度的增加，抗凋亡作用越显著，与王杰等[12]研究结果一致。Agaoglu等[20]发现，在ARC患者晶状体前囊膜及血液中SIRT1的表达较正常人明显增加。Xu等[21]在糖尿病性白内障大鼠的前囊膜中发现SIRT1表达较正常大鼠增加，与本研究SIRT1在模型组中表达高于空白对照组的结果相一致，表明SIRT1的表达水平在白内障的发展中起着至关重要的作用。另外，本研究结果中P53表达在模型组，低、中、高浓度E2组间比较无显著差异，原因可能与其翻译后修饰的功能性P53相关，SIRT1使P53去乙酰化后抑制了细胞凋亡程序，降低了细胞凋亡。E2对HLECs的保护作用可通过多种途径实现，其他途径的存在可能影响本研究结果的分析，这也是本研究的不足之处，后期仍需进一步完善实验以排除相关干扰因素的影响。

综上所述，本研究证明了生理浓度下E2对HLE-B3细胞的作用为抗凋亡作用，并进一步探讨了E2可能通过SIRT1/P53通路保护HLECs免于凋亡。但在HLECs中E2影响SIRT1/P53通路可能存在更多的作用靶点与调控机制，目前尚未完全清楚，仍需进一步探索。