酸脱钙组织苏木素-伊红染色前处理改良方案

姚莉洪 张美 黄美畅 万梓欣 张伟龙 杨肖 杨名仲 陈宇 汤亚玲

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院病理科，成都 610041

口腔颌面部由于解剖结构的特殊性，送检标本中通常会含有牙、骨组织、骨肿瘤及钙化病灶，因此，在病理制片前需用脱钙剂去除骨组织中的钙盐再进行切片。目前，使用较多的脱钙剂有以硝酸为主的酸性脱钙剂和以乙二胺四乙酸二钠（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）为代表的螯合脱钙液。EDTA较温和，染色效果较好，但组织渗透性差，脱钙耗时长，影响其应用及推广[1]。因此，人们开始尝试使用方便、耗时短的酸类脱钙剂，其中硝酸是病理工作中使用最广的酸类脱钙剂[2]。硝酸脱钙迅速，得到临床医生认可。但硝酸是强酸，对组织有酸化作用，致使常规苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后胞浆着色浓、胞核着色浅，组织细胞显微结构模糊，切片效果差。本研究旨在探究牙、骨等硬组织酸脱钙标本HE染色前处理方法，改善硬组织因酸脱钙后pH变化而引起的切片质量欠佳及HE染色组织结构不清的现象。

1 材料和方法

1.1 标本来源

随机选取2015年1—6月四川大学华西口腔医院病理科手术送检的口腔颌面部来源的含硬组织标本20例。

1.2 处理方法

10%硝酸脱钙液对硬组织标本进行脱钙，脱钙完成判断标准如下。1）物理方法：用手触及标本柔软、不刺手或大头针无阻力刺入组织标本[3]。2）化学方法：5%氢氧化铵储存液和5%草酸铵储存液配制检测工作液，与脱钙液混合，若无沉淀则脱钙完全。3）射线法：X线看组织内是否仍有钙质[4]。

脱钙后根据以下3种处理方式分组观察。1）常规处理组：酸脱钙后将样本经流水冲洗3 h以上。2）浓氨水处理组：酸脱钙后将样本经流水冲洗30 min以上，25%浓氨水浸泡1～2 h。3）饱和碳酸锂处理组：酸脱钙后将样本经流水冲洗30 min以上，饱和碳酸锂溶液（100 mL双蒸水+1.5 g碳酸锂）浸泡1～2 h。

1.3 染色切片质量评判

1.3.1 切片质量评价 组织切片外观完整，无脱片、卷片，镜下组织结构完整，无掉片缺损，对后续透明封片工作无影响，判定为良好，否则视为欠佳。

1.3.2 HE染色评价 细胞形态完好，胞核、胞质着色明显，核仁清晰，胞浆染色鲜艳，判定为良好，否则视为欠佳。

1.3.3 制片效果满意度 每一例标本均由3位病理医师评阅，其中2位或3位病理医师满意则记为良好，否则记为欠佳。

1.4 统计学方法

采用Prism 6.0进行统计学分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

3组HE染色图见图1、2。

图1 典型图例1 HE染色Fig 1 Typical picture 1 HE staining

图2 典型图例2 HE染色Fig 2 Typical picture 2 HE staining

与常规处理组（图1上、图2上）相比，饱和碳酸锂处理组（图1中、图2中）在切片质量、HE染色效果方面具有明显优势，具体表现为：HE染色着色强，胞核染色清晰，核仁明显；胞浆染色鲜艳；切片完整，无明显脱片、卷片，对后续透明封片工作无影响，病理医师对切片满意度高（P＜0.05）（表1）。浓氨水处理组（图1下、图2下）在切片质量、HE染色效果及病理医师满意度方面优势均不明显，镜下组织结构层次不清晰，HE着色较弱，胞核清晰度欠佳，胞核与胞浆对比度差。

表1 脱钙后3种处理方法切片的质量、HE染色效果及医师满意度比较Tab 1 Comparison of section quality, HE staining effect and physician satisfaction after decalcification with three methods

3 讨论

针对硝酸脱钙造成组织“过酸”这一弊端，本实验在硝酸脱钙后通过浓氨水或饱和碳酸锂溶液处理标本，以期缓解组织“过酸”，提高切片质量。结果显示：与常规方法相比，硝酸脱钙后经浓氨水或饱和碳酸锂溶液处理后组织切片质量及HE染色效果更具有优势，尽管浓氨水与常规处理相比无统计学差异。其可能机制为：氨水和饱和碳酸锂溶液为碱性溶液，可渗透到硝酸脱钙后的组织细胞内并除酸或使酸中和，使组织切片对苏木素嗜染性更强、更稳定，从而提高了苏木素着色能力，减少伊红过着色，胞核与胞质对比度好。另外，氨水和饱和碳酸锂溶液处理经硝酸脱钙的标本，缩短了传统方法硝酸脱钙后流水冲洗标本时间、操作方便，便于实施及推广[5-6]。但浓氨水处理硝酸脱钙后标本，切片质量及HE染色效果均不及饱和碳酸锂溶液，此现象是否与浓氨水作用时间不足或浓氨水作用缓慢等因素有关有待进一步研究。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。