羧胺三唑通过抑制NFAT2核转运降低小鼠CD8+T细胞中程序性死亡受体1的表达

许梦姣，高洪婷，石 婧，鞠 瑞，杨黎星，李建恒，郭 磊*

(1.河北大学 药理系，河北 保定071002；2.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院药理系，北京100005)

恶性肿瘤通过促进肿瘤微环境中细胞程序性死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)与其配体(programmed cell death-ligand 1)PD-L1的特异性结合来逃避免疫系统对其的识别、杀伤和清除，降低CD8+T细胞抗肿瘤活性[1]。为了提高免疫系统对肿瘤细胞的防治功能，提高免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤力，找到能够抑制PD-1/PD-L1从而增强T细胞功能的有效药物亟待解决。羧胺三唑(carboxyamidotriazole，CAI)是一种非细胞毒类抗肿瘤药物[2]，其具有抑制细胞外Ca2+跨膜内流的作用[3]。Ca2+浓度的变化可调控钙调磷酸酶(calcineurin，CaN)的活化进而进一步活化T细胞核因子2(activated T cell nuclear factor 2, NFAT2)[4-5]。NFAT2去磷酸化后转移至T细胞核中诱导肿瘤免疫相关基因表达，从而增强T细胞的杀伤功能[6]。因此，本研究旨在通过考察CAI能否通过调控CD8+T细胞中Ca2+的水平及钙调磷酸酶的表达来调控NFAT核转运，进而对CD8+T细胞PD-1的表达产生影响，以增强T细胞功能，为肿瘤免疫治疗提供更加安全有效地药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雌性BALB/c小鼠16只，6～8周龄，体质量18～20 g[中国医学科学院基础所动物中心，合格证号：SCXK(京)2017-0005]。

1.1.2 药品与试剂：羧胺三唑(CAI)(中国医学科学院药物所)；CD8+T细胞分选试剂盒(德国美天旎生物技术有限公司)；钙荧光探针Fluo 3-AM、共聚焦培养皿、4%多聚甲醛、0.5% Triton X-100(北京索莱宝科技有限公司)；钙调磷酸酶ELISA分析试剂盒(R&D Systems公司)；ChIP-IT® Express染色质免疫沉淀试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；Trizol试剂(Invitrogen公司)；Ca2+激活剂ZK756326(Selleck生物科技有限公司)；Anti-NFAT2抗体、Alexa Fluor-488 山羊抗兔IgG免疫荧光二抗(Abcam公司)；PD-1流式抗体、CD8流式抗体(达科为生物技术公司)；10%的胎牛血清(Gibco公司)、100 mg/mL链霉素、100 U/mL 青霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养基(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：按CD8+T细胞分选试剂盒说明书从BALB/c小鼠脾脏单细胞悬液中分选CD8+T细胞。流式细胞计量术检测细胞纯度(>95%)。用浓度为1 g/L的抗CD3/CD28磁珠激活CD8+T细胞。激活的CD8+T细胞分为4组：对照组(CON)、CAI组(加入10 μmol/L CAI)、ZK756326组(加入1.8 μmol/L ZK756326)CAI+ZK756326组(加入10 μmol/L CAI、1.8 μmol/L ZK756326)，培养在含10%血清和10 ng/mL IL-2的RPMI 1640培养基中24 h。

1.2.2 流式细胞计量术检测细胞内钙离子浓度：HBSS稀释Fluo 3-AM溶液，制备4 μmol/L的Fluo 3-AM工作液；向CD8+T细胞中加入工作液，37 ℃培养20 min；之后加入5倍体积的含1%胎牛血清的HBSS，再继续培养40 min；HEPES缓冲盐溶液洗细胞3次后用HEPES缓冲盐溶液重悬细胞，调整细胞为1×105个/mL，37 ℃下培养10 min；然后用该细胞进行荧光钙离子检测。激发波长为506 nm，发射波长为526 nm。

1.2.3 酶联免疫吸附法检测钙调磷酸酶含量：使用钙调磷酸酶ELISA分析试剂盒对CD8+T细胞培养基上清中的钙调磷酸酶进行定量。取100 μL标准品以及稀释好的细胞培养基上清加入到抗体包埋的板孔内，再加入50 μL生物素化抗体工作液，室温孵育2 h，300 μL洗涤液洗涤5次；除空白孔外，各孔加入100 μL酶结合物工作液，室温孵育1 h，300 μL洗涤液洗涤5次；各孔加入100 μL显色底物，室温避光孵育15 min；各孔加入100 μL反应终止液；450 nm波长蓝光下读取吸光度值。所有样品均一式两份测定。

1.2.4 免疫荧光染色检测NFAT2入核量：将细胞接种到共聚焦培养皿中。4 h后，细胞用4%多聚甲醛和0.5% Triton X-100固定。然后将细胞封闭在5%牛血清蛋白(BSA)中1 h，加入anti-NFAT2抗体，在4 ℃下孵育过夜，然后加入二抗(1∶1 000稀释)孵育2 h。使用共聚焦显微镜用于可视化和强度分析。

1.2.5 染色质免疫共沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)：CD8+T细胞的染色质免疫共沉淀分析按照ChIP-IT®Express Chromatin Immunoprecipitation Kits的说明书进行操作。每组细胞为5×107个。富集的DNA进行qPCR检测。引物序列：PD-1上游：5′-CCTCACC ACACTGCTAGGGAG-3′，下游：5′-CAGCAGGCTGT CAGCACATC-3′。靶基因的扩增用相对于对照组的富集倍数来表示。

1.2.6 流式细胞计量术检测小鼠脾脏细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)中PD-1+CD8+T细胞比例：分离8只小鼠脾脏CTLs, 分为对照组、CAI(10 μmol/L)组、ZK756326(1.8 μmol/L)组以及CAI+ZK756326(CAI 10 μmol/L、ZK756326 1.8 μmol/L)组，细胞在培养箱中培养24 h。收集细胞后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，然后用PBS将细胞调整为1×107个/mL，混匀，在离心管中加入100 μL细胞悬液后加入流式抗体，混匀，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗2遍，300 μL PBS重悬细胞，筛网过滤后上机检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CAI显著降低CD8+T细胞胞内Ca2+浓度和CaN的活性

与对照组相比，CAI组CD8+T细胞内钙离子水平显著降低(P<0.001)；与CAI组相比，CAI+ZK756326组胞内Ca2+浓度升高(P<0.01)(图1A)。与对照组相比，CAI组能显著降低CD8+T细胞分泌CaN(P<0.001)；与CAI组相比，CAI+ZK756326组CD8+T细胞CaN分泌减少(P<0.01)(图1B)。

A.effects of CAI on the inhibition of Ca2+influx; B.effect of CAI on the inhibition of activity of calcineurin; MFI.mean fluorescence intensity;*P<0.001 compared with control group;#P<0.01 compared with CAI group and ZK756326 group

2.2 CAI抑制NFAT2入核

与对照组相比，CAI组显著抑制了NFAT2进入细胞核(P<0.001)，而CAI+ZK756326组则促进NFAT2进入细胞核并且降低了CAI的抑制作用(P<0.01)(图2)。

2.3 CAI降低了NFAT2调控的PD-1的表达

ChIP-qPCR数据显示，与对照组相比，CAI处理后的CD8+T细胞PD-1的表达为0.28±1.06，显著低于对照组的1.01±0.10(P<0.01)。

2.4 CAI减少小鼠脾脏激活的CD8+T细胞中PD-1+ CD8+T细胞比例

与对照组相比，CAI组小鼠CTLs中PD-1+CD8+T细胞显著减少(P<0.01)；与CAI组相比，CAI+ZK756326组PD-1+CD8+T细胞比例显著升高(P<0.01)(图3)。

3 讨论

细胞程序性死亡受体1(PD-1)与其配体PD-L1特异性结合后,会抑制下游T细胞活化所需基因和细胞因子的转录及翻译,最终阻断细胞周期,从而抑制T细胞的增殖分化及细胞因子的产生[7]，这种抑制T细胞活化的作用使肿瘤细胞实现免疫逃逸[8]。因市售PD-1/PD-L1抗体药物的临床使用仍有诸如药物穿透性差、半衰期长、价格昂贵等局限性，本实验对可能具有增强T细胞活性的小分子化合物CAI展开研究，以期发现其对PD-1分子的调控和对T细胞功能的改善作用，为肿瘤免疫治疗提供更加安全有效的治疗药物。

*P<0.001 compared with control group; #P<0.01 compared with CAI group图2 免疫荧光染色显示各组NFAT2转运情况的比较

*P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with CAI group and ZK756326 group图3 小鼠脾脏CTLs中PD-1+CD8+T细胞所占比例

本研究首先检测了CAI对CD8+T细胞内Ca2+浓度、CaN表达情况和NFAT2核转运的影响。与对照组相比，CAI作用后胞内Ca2+浓度显著下降，CaN的表达降低，NFAT2入核被抑制，而加入Ca2+激活剂ZK756326后，CAI的作用被部分抵消，表明CAI的确通过降低Ca2+浓度抑制了CaN的活性，进而抑制NFAT2入核。此外，通过ChIP-qPCR实验进一步考察了NFAT2调控PD-1表达的机制，发现NFAT2结合到PD-1的启动子区域，调控编码PD-1的mRNA。另外，在小鼠脾脏CTLs中进一步验证了CAI对PD-1表达的调控作用，结果显示CAI显著降低CTLs中PD-1+CD8+T细胞所占比例，与先前结论一致。本研究证实了NFAT2能够结合到PD-1的启动子区域，从而调控PD-1的表达，影响其免疫抑制功能，为CAI作为针对免疫检查点治疗药物进行开发提供了可能。然而NFAT2与PD-1启动子的具体结合位点仍不明确，这有待进一步的实验来证实。

综上所述，鉴于CAI在肿瘤治疗过程中可通过Ca2+/CaN信号通路抑制NFAT2进入核内，从而抑制CD8+T细胞中PD-1的表达，激发CD8+T细胞的杀伤功能,恢复机体对肿瘤的免疫应答，其有望作为小分子T细胞功能调节剂，改善肿瘤免疫环境，增强T细胞杀伤能力，并可与放疗、化疗等手段合用，提升肿瘤的治疗效果。