慢性肾病大鼠心功能损伤情况及其与内质网应激的关系▲

常晋瑞 王 雪 金卓然 南 瑛 曹 健 王 倩 朱永香 孙 娜 孔令恒

(西安医学院基础医学部生理教研室，陕西省西安市 710021，电子邮箱：changjinrui8602@163.com)

慢性肾病患病率逐年增高，已成为全球范围内的公共健康问题。一些国家和地区慢性肾病患病率为8%～16%[1]，我国成年人群中慢性肾病的患病率为10.8%，且呈不断上升趋势[2]。70%的慢性肾病患者并发心血管疾病(cardiovascular disease,CVD) ，且慢性肾病患者尤其是青壮年患者，其CVD相关死亡率显著高于普通人群，为普通人群的10～20倍[3]。超声心动图研究结果提示，终末期肾病患者普遍存在左室肥厚、收缩/舒张功能障碍和心室扩张[4]。因此，预防和早期诊治CVD以降低慢性肾病患者心血管事件相关病死率，已成为亟待解决的临床问题。内质网应激参与了慢性肾病、糖尿病等多种代谢相关慢性病的发生发展[5-6]。然而，内质网是否参与慢性肾病所引起的心肌损伤仍不清楚。本研究采用5/6肾切除法制备慢性肾病大鼠模型，探讨慢性肾病大鼠心功能损伤时的内质网应激反应。

1 材料与方法

1.1 实验动物 16只无特定病原体级健康雄性SD大鼠[许可证号:SCXK(陕)2012-003]购于西安交通大学医学部实验中心，体重(200±20)g。所有动物实验均遵循西安医学院实验动物管理章程并获得伦理委员会的批准，实验前24 h禁食，自由饮水。

1.2 主要试剂与仪器 尿素氮(批号：C013-2-1)和肌酐试剂盒(批号：C011-2-1)购自南京建成生物工程研究所。葡萄糖调节蛋白94(glucose-regulated protein 94,GRP94)抗体(批号：ab13509)、 转录激活因子(activating transcription factor,ATF)4抗体(批号：ab23760)和ATF6抗体(批号：ab203119)购自美国Abcam公司；CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein,CHOP)抗体(批号：2895)购自美国CST公司；β-肌动蛋白 (批号：sc-517582)和所有二抗购自美国Santa Cruz公司。化学发光试剂盒购自北京普利莱技术公司。BL-420F生物信号采集与分析系统购自成都泰盟软件有限公司。

1.3 动物分组与模型制备 采用随机数表法将16只大鼠分为对照组和慢性肾病组，每组8只。慢性肾病大鼠模型的制备方法[7]：采用1.5%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切除右肾，7 d后切除2/3左肾。对照组用同样的方法麻醉大鼠后只撕脱肾包膜，不切除肾。肾切除术12周后，测定两组大鼠肾功能和心功能，大鼠尿素氮和肌酐水平以及左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)升高提示模型成功。

1.4 观察指标

1.4.1 肾功能测定：腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(1 g/kg) ，成功麻醉动物,无菌条件下打开腹腔。采集腹主动脉血于抗凝管中，3 000 r/min离心10 min后，取上清，采用尿素氮和肌酐试剂盒测定大鼠血清中尿素氮和肌酐含量，严格按照说明书进行操作。

1.4.2 心功能测定：用20%氨基甲酸乙酯(1 g/kg) 腹腔注射麻醉大鼠后，暴露气管和左侧颈动脉，将充满肝素(200 U/mL)的动脉导管插入颈动脉，连接BL-420 F生物机能实验系统，连续监测收缩压，将PE导管顺颈动脉插入左心室，监测LVEDP，均连续监测15 min。监测完毕后取出心脏并称重,计算心脏重量指数(heart weight index,HWI),HWI=心脏重量/体重。

1.4.3 内质网相关蛋白表达水平的检测：采用免疫印迹法检测内质网相关蛋白的表达水平。动物处死后取心肌约50 mg，加1 000 μL裂解缓冲液，匀浆后12 000 r/min离心10 min取上清，用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(西安赫特生物有限公司，批号：WB003)测定蛋白浓度,加入5×蛋白上样缓冲液。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，相应一抗稀释液(GRP94:1 ∶2 000；CHOP:1 ∶500；ATF4:1 ∶1 000；ATF6:1 ∶1 000)4℃孵育过夜，二抗(1 ∶3 000)室温孵育1 h，加入适量的电化学发光液进行曝光显色。 以β-肌动蛋白为内参,以目的蛋白的灰度值比β-肌动蛋白灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.5 统计学分析 采用GraphPad Prism 5.00软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况 建模12周后慢性肾病组大鼠体重为(373.0±12.98)g，低于对照组的(497.4±11.93)g(t=7.056，P=0.001)。慢性肾病组大鼠活动尚可，但毛发干枯，尿量较对照组增加。

2.2 两组大鼠肾功能及心功能指标比较 慢性肾病组大鼠血浆尿素氮、肌酐水平，HWI、收缩压、LVEDP均高于对照组(均P<0.05)，见表1。

表1 两组肾功能及心功能指标比较(x±s)

2.3 两组大鼠内质网相关蛋白表达水平比较 慢性肾病组大鼠心肌组织GRP94、CHOP、ATF4和ATF6蛋白的表达水平均高于对照组(均P<0.05)，见表2及图1。

图1 两组大鼠内质网相关蛋白表达水平

表2 两组大鼠内质网相关蛋白相对表达水平比较(x±s)

3 讨 论

内质网是细胞内除核酸以外的一系列重要的生物大分子合成的场所，是重要的细胞器。当各种病理因素导致内质网稳态失衡后，细胞内相应的信号通路发生改变，引发一系列的反应，称之为内质网应激[8]。经典的内质网应激包括3条主要信号通路：PKR样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)/ATF4、肌醇需求激酶1/X盒结合蛋白1和ATF6。适度的、短暂的内质网应激可作为一种防御性的机制减轻细胞功能紊乱，即未折叠蛋白反应，以恢复心肌细胞内蛋白质合成和钙稳态，从而有利于心肌损伤的修复与代偿[9]。已有研究表明，心肌缺血再灌注损伤过程中存在PERK/eIF2α/ATF4介导的内质网应激[10]。模拟心房颤动的快速电场刺激可诱导离体心肌细胞ATF4的表达，并且心房颤动患者心肌细胞核中存在ATF4的表达[11]，提示多种心功能损伤过程中存在内质网应激反应。

肾切除过多导致的肾脏代偿不全或肾炎肾病等各种肾脏疾病均可引起肾脏结构和功能损伤，若损伤持续时间超过3个月就称为慢性肾病。慢性肾病时肾小球滤过虑降低，尿毒素在体内堆积,肾性贫血、高钾血症等电解质紊乱使患者的心肌受损,心功能发生改变[12]。为探索内质网应激是否参与慢性肾病相关性心功能损伤的发生过程，我们建立慢性肾损伤大鼠模型，并检测内置网应激相关蛋白。结果显示，慢性肾病组大鼠心肌GRP94蛋白、内质网应激信号通路蛋白ATF4和ATF6的表达水平均升高，提示切除5/6肾脏12周后大鼠心肌中存在内质网应激反应。

持续和/或严重的内质网应激会导致细胞凋亡，诱导心肌肥厚从而导致心力衰竭[13]。CHOP是ATF4的下游凋亡信号，也是内质网应激介导细胞凋亡的主要途径[14]。心力衰竭患者的心肌组织中CHOP表达水平升高[15]，而中介素等物质通过抑制CHOP的表达可减轻腹主动脉缩窄诱导的心肌肥厚[16-17]、减少衣霉素诱导的心肌细胞凋亡[18]。本研究结果显示：慢性肾病组的HWI、收缩压、LVEDP均高于对照组(均P<0.05)，提示慢性肾病大鼠伴有心功能损伤；慢性肾病组大鼠CHOP表达水平升高，提示慢性肾病大鼠伴心功能损伤时存在内质网应激介导的细胞凋亡。

综上所述， 慢性肾病大鼠存在心肌损伤，其机制可能与心肌细胞内质网应激及其诱导的心肌细胞凋亡有关。