遮阴和盐分对银叶树幼苗光合特性与叶绿素荧光参数的影响

张卫强，黄芳芳，甘先华，黄钰辉

广东省森林培育与保护利用重点实验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520

盐分胁迫是影响植物生长的重要限制性因素（贾婷婷等，2018），对植物的伤害主要体现在离子胁迫、渗透胁迫及氧化胁迫等方面（潘晶等，2018），并抑制植株的光合作用来影响其生长发育（周丹丹等，2016）。光是植物光合作用和生长发育的重要影响因子，光强变化直接影响着植物的生长发育，植物对光强变化也会做出灵活的响应与适应（许大全，2013），光影响植物光合生理特性、体内营养物质吸收与分配、叶片形态与结构等生理过程，对植物生长发育产生影响（Cai，2011；Deng et al.，2012）。近年来，多数关于盐胁迫的研究主要集中在植物耐盐机制（王佺珍等，2017；潘晶等，2018）和盐分胁迫对植物生长、叶绿素、光合特性、叶绿素荧光及生理生化的影响等方面（乌凤章，2015；闫芳等，2016；陈盼飞等，2017；张雯莉等，2018；贾婷婷等，2018；潘晶等，2018），系统研究了植物对盐胁迫的适应能力与响应机制。而植物对遮阴环境的适应性研究相对较少，主要集中在遮阴对植物生长、叶形态、光合特性、叶绿素荧光、种间竞争及氮素响应机制分配的影响等方面（刘悦秋等，2007；张云等，2014；宋洋等，2016；蔡建国等，2017；李小琴等，2019；杜澜等，2019），分析了植物生长适宜的光照环境。

银叶树（Heritiera littoralis）隶属于梧桐科银叶树属，生长于潮间带与陆地，不具有胎萌、气生根及耐高渗透压等典型红树植物特征（王伯荪等，2002；曾聪等，2006），将其归为半红树植物（王伯荪等，2002）。深圳市盐灶银叶树种群分布较集中，是中国最古老的银叶树种群，已表现出濒危或易危的特征（简曙光等，2004），尤其是滨海沼泽生境银叶树群落呈现为逐渐衰退的趋势（陈晓霞等，2015），银叶树群落内，光照和盐分是影响银叶树幼苗生长与更新的重要环境因子（郭乐东等，2019），改善滨海湿地银叶树群落内光照环境和降低土壤高盐分是提升银叶树幼苗生长与更新能力的有效途径。目前，有关银叶树的研究主要集中在生物学特性（简曙光等，2005）、群落分布（简曙光等，2004）、群落结构与多样性（陈晓霞等，2015）、耐盐机理（王秀丽，2014）、遗传多样性（Jian et al.，2002）及银叶树群落优势树种分布与土壤环境、群落竞争的关系（郭乐东等，2019）等方面。开展遮阴与盐分对银叶树幼苗光合及叶绿素荧光研究鲜有报道。叶绿素荧光诱导作为联系光合作用和环境关系的内在指标，被广泛应用在植物抗逆性研究中（张国盛等，2017）。本研究以银叶树实生幼苗为研究对象，通过测定不同处理下（遮阴和施盐）叶片叶绿素含量、光合光响应参数及叶绿素荧光动力学参数，研究了遮阴和施盐处理下银叶树幼苗的光合生理及适应能力，以期为银叶树种群保育和更新提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验设在广东省林业科学研究院（广州）苗圃内，海拔25 m，典型亚热带季风气候，年平均温度23 ℃，最低月平均气温13.3 ℃（1月），最高月平均气温38.1 ℃（8月），年降水量1638 mm，4—9月的降水量占全年的80%，年平均湿度79%。

1.2 试验设计

2018年9月选取96株长势良好、生长一致的1年生实生苗移栽于上口径16 cm、下口径11.5 cm、高13.5 cm的容器，单株定植，栽培基质（黄心土与泥炭土，配置比例为5∶1）一致。实生苗平均树高33.91 cm，平均地径0.86 cm，容器苗置于大棚内，进行常规栽培管理，肥水管理一致。试验前，完成了深圳盐灶古银叶树群落沼泽生境的土壤盐分含量与透光率的测定，土壤盐分含量均值为2.5%，透光率均值约20%，以此为试验设计依据，于2018年10月实施光照和盐分交互处理试验，光处理为全光照（自然光照）及20%透光率，盐处理为不施盐及2.5%盐水处理，分别为全光照无盐（CK）、全光照施盐（FLS）、遮阴无盐（SWS）及遮阴施盐（SAS），共计4个处理，每个处理24株。选用黑色遮阳网进行遮光处理，施盐频度为每周3次，每次200 mL，60 d后停止。施盐结束后，随机抽取12盆进行土壤盐分含量测定，土壤盐分含量介于2.79%—3.01%之间，均值为2.90%。

1.3 光合光响应参数测定

光合光响应参数测定于2019年2月底至3月初进行，不同处理随机挑选4盆长势一致的植株，每株上选取2片长势一致的叶片。采用LI-COR公司生产的LI-6800型便携式光合测定仪测定叶片光合光响应参数。使用开放气路，空气流速为 0.5 L·min-1。光强选择从 1800 μmol·m-2·s-1开始，依次降为：1800、1500、1200、1000、800、600、400、200、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1。测定前叶片在1800 μmol·m-2·s-1光强下诱导 30 min，采用 CO2注入系统控制叶室CO2浓度，维持在400 mmol·mol-1左右。测定时每一光强点下最小光适应停留时间 2 min，最大光适应5 min。观测时间均为上午9:00—11:00，每叶片重复3次，连续测定3 d。依据实验数据绘制光合作用的光响应曲线（Pn-PAR），采用非直角双曲线模型（Herrick et al.，1999）进行拟合，可求得最大净光合速率（P′max）、表观量子效率（a）、暗呼吸速率（Rd）等参数。

非直角双曲线表达式为：

式中，Pn为净光合速率，PAR为光合有效辐射，a为表观量子效率，Pmax为最大总光合速率，P′max为最大净光合速率，Rd为暗呼吸速率，θ为光合曲线弯曲程度曲度；光补偿点（LCP）和光饱和点（LSP）采用Photosyn Assistant软件拟合求得。

1.4 叶绿素荧光参数测定

叶绿素荧光参数测定与光响应参数同步，每组挑选4盆长势一致的植株，每株上选取2片长势一致的叶片。利用配置调制荧光叶室（Li-6400-40）的便携式光合测定系统对叶片荧光动力学参数进行测定，测定前采用铝箔纸包裹叶片暗适应，先测定初始荧光（Fo）、最大荧光（Fm）、最大PSII的光能转换效率（Fv/Fm），然后打开活化光（1800 μmol·m-2·s-1），测定光适应下初始荧光（Fo′）、光适应下最大荧光（Fm′）、光适应下稳态荧光（FS）、光适应下最大可变荧光（Fv′），并计算光化学淬灭系数（qP）、非光化学猝灭系数（NPQ）、表观量子传递速率（ETR）及实际光化学效率（ΦPSⅡ）等参数。测定时间为上午9:00—11:00和下午14:00—16:00，每叶片重复3次，连续测定3 d。吸收光能用于天线热耗散 (D)=(1-Fv′/Fm′)×100%，光化学耗散 (P)=qP×Fv′/Fm′×100%，PSII反应中心非光化学能量耗散 (E)=(1-qP)×Fv′/Fm′×100%（Ehlert et al.，2008）。

1.5 叶绿素含量测定

叶绿素含量测定于2019年3月初进行，随机选取不同处理银叶树各6株，摘取新鲜叶片，擦拭干净，去主脉，剪碎混匀。称取0.2 g，每处理3次重复，以95%丙酮研磨，提取，过滤，定容至25 mL，采用分光光度计测定提取液的吸收光谱，然后读出各提取液分别在664、647、466 nm处的吸光度。计算每克叶片的叶绿素a（Chla）、叶绿素b含量（Chlb）（Pires et al.，2011）。

1.6 数据分析与统计方法

利用Microsoft Excel 2016整理原始数据，利用Two-way ANOVA分析光照和盐分处理对光合特性和叶绿素荧光参数的影响，利用 Duncan法进行各参数指标间显著性检验，所有分析在SPSS 16.0统计软件进行。

2 结果与分析

2.1 遮阴与施盐对银叶树叶绿素的影响

光和盐处理对叶绿素含量、叶绿素a/b影响不显著（P＞0.05），二者不具有交互作用；光处理对叶片Chlb、Chl(a+b)及Chla/b存在显著与极显著的影响，而对Chla影响不显著；盐处理对Chla、Chlb、Chla/b及Chl(a+b)存在极显著的影响；盐分对叶绿素含量影响高于光照（表1）。在无盐条件下，CK与 SWS处理间 Chla或 Chl(a+b)差异不显著（P＞0.05），而 Chlb或 Chla/b存在显著差异（P＜0.05）；遮阴提高了 Chla、Chlb及 Chl(a+b)含量，增幅分别为10.26%、48.49%及18.67%，而遮阴显著降低了Chla/b值（P＜0.05），降幅达38.78%。在施盐条件下，SAS处理下叶片Chlb和Chl(a+b)显著高于FLS处理相应值（P＜0.05），表明遮阴显著提高了叶片 Chlb与 Chl(a+b)含量，增幅分别为127.27%与 84.09%，而遮阴显著降低了 Chla/b值（P＜0.05），降幅为 25.33%。无论全光照或遮阴，施盐均显著降低了 Chla、Chlb及 Chl(a+b)含量（P＜0.05）。不同处理下 Chla、Chlb及 Chl(a+b)变化趋势一致，均表现为SWS＞CK＞SAS＞FLS。

2.2 遮阴与施盐对银叶树光合光响应参数的影响

当 PAR 为 0 μmol·m-2·s-1时，Pn为负值，在弱光下，随着PAR增强，Pn急剧升高，两者呈线性关系，表明此时光是光合作用的主要限制因素；在无盐条件下，当 PAR 达到 1000 μmol·m-2·s-1时，Pn上升趋势减缓并趋向平稳；而在施盐条件下，当PAR为 200 μmol·m-2·s-1时，Pn上升趋势减缓，随着 PAR的增加，Pn呈平缓下降趋势（图1）。光和盐处理对叶片AQY、P′max及LSP影响不显著（P＞0.05），二者不具有交互作用；而光和盐处理对叶片Rd和LCP存在极显著的影响（P＜0.01），二者存在极显著的交互作用（表2）；光处理对Rd、LCP及AQY存在极显著与显著影响，对P′max和LSP影响不显著；盐处理对AQY、P′max、Rd及LSP影响极显著（P＜0.01）；盐分对AQY、P′max、LSP影响显著高于光照。在无盐条件下，遮阴显著提高了叶片AQY（P＜0.05），在施盐条件下，遮阴却降低了AQY。无盐下P′max与LSP显著高于施盐（P＜0.05），说明施盐对P′max与LSP影响显著。全光无盐下叶片Rd、LSP及LCP显著高于其它处理（P＜0.05），表明遮阴或施盐降低了Rd、LSP及LCP。在遮阴或施盐处理下，银叶树通过降低LCP、LSP来提高对弱光的利用能力，并通过降低呼吸消耗以维持植株正常生长，从而表现出了较强的适应能力。

2.3 遮阴与施盐对银叶树荧光参数的影响

初始荧光（Fo）和最大荧光（Fm）反映PSII反应中心完全开放和完全关闭时的荧光产量（周丹丹等，2016）；可变荧光（Fv）代表原初电子受体（QA）的还原状态（张守仁，1999）；Fv/Fo反映PSII最大量子效率（闫芳等，2016）。光和盐处理对银叶树幼苗叶片Fo、Fm、Fv及Fv/Fo荧光参数影响不显著（P＞0.05），二者不存在交互作用；而光处理或盐处理对Fm、Fv、Fv/Fo影响极显著（P＜0.01），盐处理对Fo、Fm、Fv、Fv/Fo影响高于光处理（表3）。银叶树幼苗受到盐分胁迫后叶片Fo有所增加，可能与PSII反应中心的 D1蛋白失活有关（Yang al.，2001），而Fm、Fv及Fv/Fo均有不同程度的降低，其中降幅最大为FLS处理，与对照存在显著差异（P＜0.05），说明FLS处理下银叶树幼苗叶片PSII反应中心已因盐胁迫而受到了伤害，其潜在活性和原初光能转换效率明显减弱，产生了明显的光抑制（闫芳等，2016）。

表1 遮阴与施盐对银叶树叶绿素含量及比值的影响Table 1 Effects of shade and salt treatments on chlorophyll content and proportion in leaves of Heritiera littoralis

图1 不同处理下银叶树叶片的光响应曲线Fig.1 Light response curves of net photosynthetic rate (Pn)in Heritiera littoralis under shade and salt treatments

Fv/Fm是暗反应下PSII最大光化学效率，Fv/Fm值变化可以反映光抑制的程度，比值越高其发生光抑制的程度越低（曹永慧等，2012）；Fv′/Fm′是 PSII有效光化学量子产量，反映开放的PSII反应中心原初光能捕获转化效率（闫芳等，2016）。光和盐处理对Fv/Fm、Fv′/Fm′影响不显著（P＞0.05），二者不存在交互作用；而盐或光处理均对Fv/Fm与Fv′/Fm′产生显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）的影响，盐分的影响高于光照（表 4）。在无盐或施盐条件下，遮阴提升了PSII原初光能的转化效率（Fv/Fm）和PSII有效光化学量子产量（Fv′/Fm′）；而在全光或遮阴条件下，施盐降低了Fv/Fm和Fv′/Fm′。不同处理下Fv/Fm和Fv′/Fm′分别介于 0.54—0.80 和0.25—0.49之间，两者变化规律一致。Fv/Fm在CK、SWS及SAS处理间显著差异（P＞0.05），但显著高于FLS（P＜0.05），表明在FLS下银叶树幼苗发生光抑制程度明显（图 2）；Fv′/Fm′在 CK、FLS 及 SAS间差异不显著（P＞0.05），但 CK 处理Fv′/Fm′明显高于FLS处理，表明FLS处理下银叶树幼苗原初光能转换效率降低。

表2 遮阴与施盐对银叶树光响应特性的影响Table 2 Effects of shade and salt treatments on photosynthesis-light response parameters of Heritiera littoralis

表3 遮阴与施盐对银叶树叶片Fo、Fm、Fv及Fv/Fo的影响Table 3 Effects of shade and salt treatments on Fo,Fm,Fv,Fv/Fo' of Heritiera littoralis

表4 遮阴与施盐对银叶树叶片Fv/Fm等荧光参数的影响力分析Table 4 Effects of shade and salt treatments on fluorescence Parameters of Fv/Fm in Heritiera littoralis

图2 遮阴与施盐对银叶树PSII最大光化学效率（Fv/Fm）和PSⅡ有效光化学量子产量（Fv′/Fm′）的影响Fig.2 Effects of shade and salt treatments on maximal quantum efficiency of PSII(Fv/Fm)and actual photochemical efficiency of PSII (Fv′/Fm′)of Heritiera littoralis

PSII实际光合效率（ΦPSⅡ）是反映电子传递活性与传递速率。表观光合量子传递效率（ETR）是光合机构吸收光能发生电荷分离产生电子并沿电子传递链向下传递的速率，反映实际光强条件下的表观电子传递效率（史彦江等，2012）。光和盐处理对ΦPSⅡ与ETR影响不显著（P＞0.05），二者没有交互作用（图3）；而盐或光处理均对ΦPSⅡ与ETR产生极显著影响（P＜0.01），盐分的影响高于光照（表4）。不同处理下ΦPSⅡ与ETR变化规律一致，均表现为CK＞ SWS＞FLS＞SAS，CK下ΦPSⅡ或ETR显著高于其它处理（P＜0.05），表明SWS、FLS及SAS处理显著降低了PSⅡ反应中心电子传递活性及传递效率。

光化学猝灭系数（qP）反映了PSII反应中心的开放程度，qP越大，表明PSII的电子传递活性越大（Van Kooten et al.，1990）；非光化学淬灭系数（NPQ）是 PSII天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分，反映了光系统对过剩光能的耗散能力（张守仁，1999；闫芳等，2016）。光和盐处理对qP与 NPQ影响不显著（P＞0.05），二者没有交互作用，盐处理对qP与NPQ不显著（P＞0.05），而光处理对qP影响极显著（P＜0.01）（表4）。qP在CK与FLS处理间差异不显著（P＞0.05），显著高于 SWS与 SAS处理（P＜0.05），SWS与SAS处理下qP仅为CK的52.14%和38.80%，表明SWS与SAS处理下PSII中开放程度与电子传递活性降低（图 4）。NPQ表现为CK＞SWS＞FLS＞SAS，与ΦPSⅡ与ETR变化趋势一致，CK处理下NPQ值显著高于SAS（P＜0.05），说明 SAS处理显著降低了光合色素所吸收的光能用于保护性耗散比例（图4）。

2.4 遮阴与施盐对银叶树吸收光能的影响

图3 遮阴与施盐对银叶树实际光合效率（ΦPSⅡ）和表观电子传递速率（ETR）的影响Fig.3 Effects of shade and salt treatments on actual photosystem II efficiency (ΦPSⅡ) and electron transport rate (ETR) of Heritiera littoralis

图4 遮阴与施盐对银叶树光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭系数（NPQ）的影响Fig.4 Effects of shade and salt treatments on photochemical quenching (qP),non-photochemical quenching (NPQ) of Heritiera littoralis

植物叶片吸收的光能分为天线热耗散的能量（D）、光化学反应的能量（P）及反应中心有非光化学反应耗散的能量（E）（Depuydt et al.，2009），分析吸收光能的分配将有助于了解植物叶片对吸收光能的分配策略（胡文海等，2015）。光和盐处理对D、E、P影响不显著（P＞0.05），二者没有交互作用；光或盐处理对D、E、P影响达到极显著（P＜0.01），盐分对D、P影响高于光照（表5）。P表现为：CK＞SWS＞FLS＞SAS，表明CK下银叶树幼苗将吸收的光能较多的用于光化学反应，而SAS处理下用于光化学反应光能份额最低。FLS和SAS处理下天线热耗散（D）与对照相比均有不同程度的升高，此时叶片具有较高的可调控生理代谢，能够将过剩的光能较多地分配给热耗散（蔡建国等，2017），而热耗散比例的增加反映了FLS和SAS处理下银叶树幼苗光能捕获效率降低，银叶树幼苗处于光抑制状态。E表现为SWS＞SAS＞CK＞FLS，在SWS和SAS处理下，较高的E值表明PSII光化学反应和保护性调节机制没有发挥作用，积累了大量的激发能，这有可能会对PSII反应中心产生破坏作用（蔡建国等，2017）。正常环境下，银叶树幼苗叶片吸收的能量约60%用于热耗散，约32%用于非光化学反应，仅有8%的能量用于光化学反应，说明在饱和光环境下银叶树叶片将过剩光能以热耗散途径释放，削弱了反应中心过量激发能的积累（蔡建国等，2017）。

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 遮阴与施盐对叶绿素的影响

叶绿素作为光合色素中重要的色素分子，参与了光合作用中光能的吸收、传递和转化（闫芳等，2016）。在无盐条件下，遮阴增加了银叶树幼苗叶片Chla、Chlb及Chl(a+b)含量，促进了叶片中叶绿素b的合成，Chlb含量增幅显著，增加了叶绿素b对蓝紫光部分的吸收能力（刘悦秋等，2007），表明银叶树幼苗处于弱光环境下的生理适应及对弱光利用能力强。在全光条件下，施盐显著降低了Chl(a+b)、Chla、Chlb含量及Chla/b比值，这与闫芳等（2016）研究结果一致，这可能是由于盐分胁迫下植物体内活性氧和叶绿素水解酶活性增加，破坏了叶绿体结构，叶绿素合成缓慢，分解增加，导致叶绿素含量降低（Agastian et al.，2000），进而影响光能吸收、转化，导致光合速率下降（李海波等，2006）。有研究表明，阳性植物的Chla/b约为3，耐荫植物的Chla/b约为2.3（孙小玲等，2010），银叶树幼苗正常环境下叶片Chla/b为3.65，属阳性植物。

3.1.2 遮阴与施盐对光合光响参数的影响

LSP和 LCP分别代表植物光合作用的光照强度上限和下限，同时也反映了植物叶片对强光和弱光的利用能力（蔡建国等，2017）。耐阴植物的LCP小于 20 μmol·m-2·s-1，LSP 为 50—1000 μmol·m-2·s-1或更低（Boardman，1977）。正常环境下银叶树LSP和 LCP 分别为 1023、28.8 μmol·m-2·s-1，说明银叶树为阳性植物。在无盐条件下，遮阴显著提高了银叶树幼苗AQY，却显著降低了LSP、LCP及Rd，这与王凯等（2009）、宋洋等（2016）及蔡建国等（2017）的研究结果类似，说明遮荫处理下银叶树幼苗叶片通过降低LSP和LCP来提高对弱光的利用能力，同时降低呼吸消耗以维持植株正常生长，表现出较强的适应能力（蔡建国等，2017）。施盐显著降低了银叶树幼苗AQY、P′max及LSP，致使银叶树幼苗利用弱光能力和光合潜力降低，这可能是由于盐胁迫激发渗透胁迫，导致气孔关闭，引起光合作用的气孔限制（贾婷婷等，2018；许大全，2013）。

表5 不同处理下银叶树叶片吸收光能的分配Table 5 The distribution of light energy absorbed in Heritiera littoralis under shade and salt treatments treatments

3.1.3 遮阴与施盐对叶绿素荧光参数的影响

Fv/Fm反映PSII反应中心最大PSII光能转换效率（王文林等，2013）。正常情况下，没有环境胁迫并经过充分暗适应的植物叶片Fv/Fm是比较恒定的，一般为 0.80—0.85（许大全，2013）。FLS处理下Fv/Fm与对照相比显著下降了 28.57%，表明此时盐分胁迫使PSII受到了伤害，最大PSII光能转换效率减弱，植物体内发生了光合作用的光抑制。不同处理下银叶树幼苗ΦPSⅡ与 ETR变化趋势一致，均表现为全光无盐 (CK)＞遮阴无盐 (SWS)＞全光施盐(FLS)＞遮阴施盐 (SAS)，表明遮阴或施盐使ΦPSⅡ与ETR降低，而施盐对ΦPSⅡ与ETR的影响高于遮阴，这主要是由于盐胁迫使银叶树幼苗发生了明显的光抑制，致使PSII潜在活性中心受到损伤，PSII的光化学活性受抑制，光能转换效率与电子传递能力下降（闫芳等，2016；乌凤章，2015），而遮阴一定程度增加了PSII潜在活性，降低了PSII反应中心因失活而出现光抑制（蔡建国等，2017）。银叶树幼苗qP表现为全光施盐 (FLS)＞全光无盐 (CK)＞遮阴无盐 (SWS)＞遮阴施盐 (SAS)；在无盐或施盐条件下，遮阴降低了银叶树幼苗qP，PSII反应中心的开放程度与电子传递活性降低，银叶树天线色素吸收的光能有相当一部分用于热耗散，降低光能对光合系统产生破坏。高的 NPQ有利于过剩光能的及时耗散，避免光系统的损害，并能够将更多的光能用于光合电子传递（冯汉青等，2013；周丹丹等，2016）；不同处理下NPQ变化趋势与ΦPSⅡ与ETR趋势一致，表明遮阴或施盐降低了PSII天线色素吸收光能以热的形式耗散的比例，尤其是在SAS处理下，PSII过剩光能以热耗散的比例减少，降低了光能转化效率与光合电子传递能力，增加了过剩光能对光系统的破坏的风险。

3.2 结论

植物叶绿素含量、光合光响应参数及叶绿素荧光参数均可作为快速准确的判断银叶树幼苗耐阴与耐盐程度的重要指标。光和盐对叶绿素含量、光合光响应参数（AQY、P′max及LSP）及叶绿素荧光参数的影响没有交互作用，盐对叶绿素含量、光合光响应参数（AQY、P′max及LSP）及叶绿素荧光参数（Fo、Fm、Fv、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR 及 NPQ）的影响高于光照。在正常环境下，银叶树为阳性树种，其幼苗表现出较高的耐阴性及对弱光的利用能力。盐胁迫使银叶树幼苗发生了明显的光抑制，PSII的光化学活性受抑制，过剩光能对光系统的破坏的风险增加，光能转换效率与电子传递能力下降，光合作用效率大幅降低。