热带山地雨林土壤球囊霉素的分布特征

张梦歌，石兆勇,2,3*，杨梅，卢世川，王旭刚，徐晓峰

1.河南科技大学农学院，河南 洛阳 471000；2.洛阳市共生微生物与绿色发展重点实验室，河南 洛阳 471000；3.北京大学/地表过程分析与模拟教育部重点实验室，北京 100871

球囊霉素（GRSP）是植物共生丛枝菌根真菌所分泌的一类含有金属离子的糖蛋白，是土壤有机质的重要组成部分和重要来源（He et al.，2010），具有稳定和改善土壤结构及提高土壤固定有机碳的能力（吴阳等，2018）。因此，土壤球囊霉素常被作为表征土壤质量和土壤碳库变化的重要指标（黄彬彬等，2019）。丛枝菌根（AM）是土壤中丛枝菌根真菌（AMF）与植物形成的互惠共生体，是热带雨林生态系统中的主要菌根类型，能与热带雨林中的绝大多数植物形成共生关系（Smith et al.，2011）。研究表明，丛枝菌根真菌和植物共生可以促进植物吸收土壤中的氮、磷等养分，改善宿主植物的营养状况，从而有利于植物的生长，为植物提供良好的物质基础（Barea et al.，2011）。球囊霉素作为丛枝菌根真菌的代谢产物，广泛存在于土壤生态系统中，在一定程度上反映了丛枝菌根真菌的生长状况和繁殖能力。Rillig et al.（2003）认为，球囊霉素是土壤C库和N库的重要来源，其黏附力有利于稳定土壤结构，是丛枝菌根真菌对植物生长环境的调整与适应。田蜜等（2013）研究认为丛枝菌根不仅能改善土壤结构和植物的营养状况，还能提高植物对环境胁迫的抗性等功能，对热带雨林生态系统具有重要意义。

由于球囊霉素的重要生态功能，使其在各种生态系统土壤中的含量和分布引起了人们的广泛关注（景航等，2017）。目前对球囊霉素的研究主要集中在农田、草地、荒漠（仲召亮等，2016；郭亚楠等，2017）生态系统。唐宏亮等（2009）在农田生态系统的研究发现，土地利用方式不同而导致了土壤球囊霉素含量的明显不同。贺学礼等（2018）基于沙化梁地生态系统的研究则表明，球囊霉素含量及分布随不同坡度的变化而存在明显的空间异质性。因此，土壤球囊霉素含量在不同生态系统中，具有不同的分布特征。热带雨林是功能、结构最为复杂的生态系统，由于研究手段的局限性，前人对热带雨林生态系统中球囊霉素的研究，主要集中在相同海拔梯度上，并证明其在热带雨林土壤固碳方面发挥着重要作用（Rillig et al.，2001；Lovelock et al.，2004）。但是，热带雨林在不同海拔梯度上通常存在着明显的植被垂直地带分布，可能会影响到丛枝菌根真菌的群落和多样性（Bonfim et al.，2016），进而导致其分泌物——球囊霉素含量的差异。因此，通过对山地不同海拔梯度球囊霉素含量及其分布规律的探究，从而准确评价球囊霉素、乃至丛枝菌根在热带雨林中所扮演的角色，为今后利用球囊霉素对热带山地雨林土壤结构改善方面、土壤养分有效利用方面提供理论依据。本研究选择我国保存最为完好的热带雨林——尖峰岭为对象，研究了其不同海拔梯度土壤球囊霉素的含量及其空间分布特征，并结合土壤因子的变化，进一步分析了尖峰岭热带雨林土壤球囊霉素的变异机制，以期为热带雨林生态功能评价提供新策略。

1 材料与方法

1.1 研究地点概况

本研究选择海南尖峰岭热带雨林为研究对象。尖峰岭地区位于海南省西南部（18.33°—18.95°N，108.68°—109.20°E），总面积约640 km2（李艳朋等，2016）。处于低纬度热带岛屿季风气候区，干湿两季明显。该地区年平均降水量2449 mm，年平均气温24.5 ℃，最高海拔1412 m（方精云等，2004）。选择尖峰岭进行研究，是因为尖峰岭是世界上热带雨林植被保存最为完好的地区之一，被认为是“人与生物圈”计划研究最为理想的地方，类型齐全，可以进行所有学科的研究。

1.2 样品的采集与处理

在尖峰岭选择4个海拔梯度，分别为300、600、900、1200 m，在每个目标海拔高度上设置宽度为50 m的采样带；在采样带中，以50—100 m水平间隔设置3个20 m×20 m的样方；每个样方划分为25个4×4 m的样区，在每个样区，用土钻随机采集直径为2 cm的2个0—30 cm土柱样品。每个样方采集50个土壤样品进行充分混匀，采用逐级四分法，保留约1 kg土壤连同根系样品，放入装有干冰的冰盒中带回实验室。在实验室挑选出土壤中的细根，用于测定菌根侵染率，土壤用于测定球囊霉素和土壤理化特性。

1.3 试验方法

1.3.1 丛枝菌根真菌侵染率和球囊霉素的测定

丛枝菌根真菌侵染率按Phillips et al.（1970）和刘润进等（2007）的方法测定计算。主要测定步骤：选取新鲜的细根，放入盛有质量分数为10%氢氧化钾溶液的试管中，90 ℃水浴锅中加热30 min。冲洗干净后加入体积分数5%的醋酸浸泡5 min，然后倒掉醋酸用体积分数 5%的醋酸墨水进行染色，在90 ℃水浴锅中加热。染色后挑出30条粗细一致的根段制作装片放在显微镜下观察侵染情况并记录结果。计算方法：在显微镜下观察每条根段的侵染情况，根据每段根系菌根结构的多少，按0、10%、20%、30%……100%的侵染数量给出每条根段的侵染率。依照公式可计算该样品菌根的侵染率：∑(0×根段数+10%×根段数+20%×根段数+……+100%×根段数)/观察总根段数。

球囊霉素的测定包括易提取球囊霉素和总提取球囊霉素，按Wright et al.（1996）和David et al.（2008）的方法测定。易提取球囊霉素测定的主要步骤：取1 g风干土在试管中，加入8 mL、20 mmol·L-1（pH=7.0）柠檬酸钠浸提剂，在103 kPa、121 ℃条件下连续提取90 min后，在6000 r·min-1下离心15 min，收集上清液；总球囊霉素提取方法：取1 g风干土于试管中，加入 8 mL、50 mmol·L-1（pH=8.0）柠檬酸钠浸提剂，在103 kPa、121 ℃条件下连续提取60 min，再重复提取2次；6000 r下离心15 min，收集上清液。分别吸取上清液0.5 mL加入5 mL考马斯亮蓝G-250染色剂，在595 nm波长下比色。用牛血清蛋白作为标准液，考马斯亮蓝法显色，绘制标准曲线，求出球囊霉素含量。

1.3.2 土壤理化性质的测定

土壤全碳、全氮含量用元素分析仪测定（张威等，2009），土壤全磷含量测定采用高氯酸-浓硫酸消煮-钼锑抗比色法测定（鲁如坤，2000），土壤pH采用精密酸度计（pHS-3C）测定。

1.4 数据处理

对土壤 T-GRSP、EE-GRSP、植物根系的菌根侵染率和GRSP与土壤全碳的比值，采用在4个海拔间进行P＜0.05水平上单因素方差分析的方法，具体用 Duncan多重比较法检验其差异的显著性。对于土壤因子（全碳、全氮、C/N、pH、全磷）对GRSP含量的影响，则采用线性回归的方法进行分析。所有数据都运用SPSS 21.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同海拔丛枝菌根真菌的侵染状况

图1 不同海拔（H）丛枝菌根真菌的侵染状况（C）Fig.1 Colonization status (C) of arbuscular mycorrhizal fungi at different altitudes (H)

对尖峰岭不同海拔根系进行菌根侵染率的测定，丛枝菌根真菌在不同海拔梯度均能与根系形成较好的共生关系，4个海拔的平均侵染率达到82.92%（图1）。从4个海拔的菌根侵染率来看，仅在600 m和1200 m之间存在显著的差异，在海拔600 m时，菌根侵染率最低，也达到74.88%，而在1200 m时最高，为92.86%。可见，在尖峰岭的各海拔中，丛枝菌根的侵染率都比较高，且受海拔梯度变化的影响较小。

2.2 不同海拔土壤因子的含量

对尖峰岭不同海拔梯度土壤因子含量及C/N的测定发现，土壤全碳和全氮含量在各个海拔的变化一致，都是在1200 m海拔时显著高于其他3个低海拔（表1）。C/N随海拔的升高呈现显著增大的趋势。pH在各海拔的变化范围在4.85—5.48之间，且2个低海拔与2个高海拔相比，土壤pH呈现显著性变化。尖峰岭土壤全磷含量在0.18%—0.29%之间，只有在300 m海拔和600 m海拔时差异显著。

2.3 不同海拔土壤球囊霉素的含量及其对土壤碳的贡献

尖峰岭不同海拔梯度土壤总提取和易提取球囊霉素含量的变化范围分别为1.79—3.11 mg·g-1和0.75—1.13 mg·g-1，两项测试指标的最大值均出现于1200 m 的海拔，分别为 3.11 mg·g-1和 1.13 mg·g-1（图2）。不同的海拔梯度间，总提取和易提取球囊霉素含量的变化规律一致，都是在900 m以下低海拔梯度时，总提取和易提取球囊霉素含量差异不显著，而与海拔1200 m相比，存在显著性的差异。球囊霉素作为土壤碳库的重要来源，通常用土壤球囊霉素与土壤全碳的比值，来测定球囊霉素对土壤碳库的贡献（图 2）。尖峰岭土壤总提取球囊霉素与易提取球囊霉素对土壤全碳的贡献范围分别为4.33%—8.87%、1.58%—4.12%。总提取球囊霉素与易提取球囊霉素在4个海拔梯度间，对土壤全碳的贡献呈现相同的规律，都是在海拔1200 m时，显著低于其它低海拔对土壤全碳的贡献值。

2.4 球囊霉素含量与土壤因子间的关系

通过对球囊霉素与土壤因子（全碳、全氮、磷、pH）间的分析表明，总提取球囊霉素和易提取球囊霉素均与土壤全碳、全氮、碳氮比的含量呈显著正相关关系（图3）。对于碳而言，土壤总提取球囊霉素随着碳含量的增加而增大，两者呈现线性关系，解释率为63.16%，即土壤全碳每增加1%，总提取球囊霉素就增加0.21 mg·g-1。碳与土壤易提取球囊霉素的含量也呈线性相关关系。随着土壤中全氮含量的增大，土壤总提取球囊霉素和易提取球囊霉素都呈现线性增加的趋势。与碳相似，总提取球囊霉素与土壤全氮线性关系的解释率高于易提取球囊霉素，分别为58.94%和32.19%。土壤总提取球囊霉素和易提取球囊霉素随着碳氮比的增加显著增大。且土壤总提取、易提取球囊霉素含量与全碳、全氮、碳氮比都呈极显著相关关系（P＜0.01）。土壤总提取球囊霉素与易提取球囊霉素含量都随 pH的增大而呈现下降的趋势，但 pH与易提取球囊霉素呈显著相关关系（P＜0.05），而与总提取球囊霉素没有相关关系（P＞0.05）磷含量与总提取球囊霉素和易提取球囊霉素也没有明显的相关关系（P＞0.05）。

表1 不同海拔高度土壤因子的含量Table 1 Contents of Soil Factors at Different Altitudes

图2 不同海拔土壤球囊霉素（GRSP）的含量及其对土壤碳的贡献（r）Fig.2 The content of glomalin (GRSP) in soil at different altitudes and its contribution (r) to soil carbon

3 讨论

热带雨林植被是丛枝菌根植物占优势物种的区域（Camenzind et al.，2016；Shi et al.，2019），本研究的结果表明，在尖峰岭4个海拔植物的菌根侵染率都很高，处于74.88%—92.86%之间，平均达到82.92%，这与以往的研究结果类似，如石兆勇等（2007）针对五指山植物丛枝菌根共生状况的研究中，就表明侵染率最高可达90.5%。Shi et al.（2006）针对热带 Meliaceae科的植物的研究，其菌根侵染率也高达95%。鄂晓伟等（2019）对亚热带阔叶林的研究也得到了相似的结论。可见，热带雨林植物能够与丛枝菌根真菌形成良好的共生关系。从4个海拔的侵染率来看，仅在600 m和1200 m之间存在显著差异，这可能是与菌根侵染率随海拔变化的规律不一致所导致的，如Shi et al.（2014）在秦岭太白山 19个海拔的研究表明，菌根侵染率随海拔呈现出三次方程函数的变化关系；而赵飞等（2015）针对青藏高原的5个海拔梯度的研究发现，植物的菌根侵染率除在最高海拔处显著低于其它4个低海拔区域外，4个低海拔间无显著差异。可见，植物的菌根侵染率随海拔的变化，并无一致的规律，这可能也与土壤因子有关（Camenzind et al.，2016）。当然，针对于不同的区域和生态系统的情况，还有待进一步探讨。

尖峰岭土壤总提取和易提取球囊霉素含量在 3个低海拔土壤中的变化不显著，仅在1200 m时显著高于低海拔土壤球囊霉素的含量，与祝飞（2010）在热带地区关于球囊霉素的研究结果一致，其原因可能是随着海拔的升高，人为干扰程度降低，光照比较充足，因此导致球囊霉素含量高于其他海拔，且在1200 m时，丛枝菌根真菌与根系的侵染率也最高，这一结果和分泌的球囊霉素最高是一致的。有研究表明，不同生态系统中总提取球囊霉素含量范围为2.0—14.8 mg·g-1（张亚娟，2017），但生态系统之间土壤球囊霉素的含量差异明显。王建等（2016）的研究发现耕地及果园等长期耕作的土壤中球囊霉素含量低于林地、草地。本研究中发现尖峰岭土壤总提取球囊霉素平均含量为2.205 mg·g-1，易提取球囊霉素的平均含量为 0.904 mg·g-1，高于张亚娟等（2017）在荒漠地区所测定的球囊霉素含量。在4个海拔土壤中易提取球囊霉素占土壤全碳的 1.58%—4.12%，总提取球囊霉素占土壤全碳的4.33%—8.87%，高于Rillig et al.（2001）所研究的在热带山地雨林中，总提取球囊霉素占到整个土壤全碳含量的4%—5%。可能是由于近年来，灾害天气、农工业化污染等自然因素和人类活动引发了一系列生态问题，导致生态系统服务功能衰减；气候的改变导致土壤养分含量流失（李珂等，2017），所以球囊霉素占土壤全碳的含量有所提高。这充分说明球囊霉素是土壤碳库的重要来源和组成部分。也有研究表明，球囊霉素是一类难溶于水，难于分解，并且在土壤中性质极为稳定的蛋白质（王建等，2016），因此球囊霉素的含量也与成土时间有关。本研究中海拔对热带山地雨林球囊霉素含量的有限影响，可能是受样地环境因素和植物种类等多种因素综合影响的结果。

有研究表明，热带森林在全球碳循环中起着非常重要的作用，热带森林土壤碳储量占全球碳库的11%（Malhi et al.，1999）。本研究中，尖峰岭土壤平均全碳含量为4.04%，与周李磊等（2016）所研究的新疆伊犁草地生态系统中土壤的全碳含量（4.25%）相近。土壤中的氮主要来源于凋落物归还，大气沉降以及固氮植物（蒲洁等，2015）。本研究中全氮含量范围为1.65—4.25 mg·g-1，平均全氮含量为2.48 mg·g-1，高于我国陆地土壤全氮含量水平（2.3 mg·g-1）（Tian et al.，2010）。可能是随着海拔的升高，气温逐渐降低导致土壤全氮矿化速率变弱，所以在海拔1200 m时土壤全氮含量最高。张巧明等（2011）研究发现秦岭土壤全氮在高海拔时含量较高，其结果与本研究一致。土壤C/N是衡量有机质分解速率、评价土壤质量的敏感指标。在尖峰岭热带山地雨林中，C/N的平均值变化范围在12.43—18.68之间，高于我国土壤 C/N的平均值10—12（朱秋莲等，2013）。证明尖峰岭土壤有机质分解速度较好。在球囊霉素含量与土壤因子关系的研究中发现，总提取和易提取球囊霉素含量随着土壤全碳含量、全氮含量、C/N含量的增加而增加，且都呈现极显著正相关关系，近一步证实了球囊霉素是土壤碳库和氮库的重要来源，这与谢靖等（2012）的研究结果一致。尖峰岭土壤平均全磷含量为 0.23 mg·g-1，远低于全国平均水平（0.56 mg·g-1）（Tian et al.，2010）。显著性分析结果也表明，总提取和易提取球囊霉素含量与土壤全磷含量没有明显的相关关系。可能是因为磷作为一种沉积性的矿质元素，在土壤中的迁移率很低，主要依靠岩石的风化，其含量相对稳定（张亚娟等，2017），因此土壤全磷含量在整个空间中的分布较为均匀。本研究尖峰岭土壤pH的变化范围在4.93—5.48之间，与易提取球囊霉素含量呈现显著负相关关系，但与总提取球囊霉素的含量没有显著性影响。可能是因为提取球囊霉素时浸提剂有pH的要求，而酸性土壤干扰易提取球囊霉素的测定。测定总提取球囊霉素时浸提了多次，消除了其对总提取球囊霉素的干扰。因此可说明在微酸性环境中，植物能与丛枝菌根真菌形成良好的共生关系，且对分泌球囊霉素没有影响。

图3 球囊霉素含量与土壤因子间的关系Fig.3 The relationship between glomalin content and soil factors

4 结论

（1）热带山地雨林尖峰岭土壤中有较高的球囊霉素含量，其植物根系具有较高的侵染率。

（2）在尖峰岭热带雨林中，海拔对于土壤球囊霉素含量具有有限的影响。

（3）热带山地雨林土壤球囊霉素含量随土壤全碳、全氮、C/N的增加而增加。