超声萃取-高效液相色谱分析法测定土壤中2-氯-6-(三氯甲基)吡啶

苏红鸽, 张忠庆, 刘金华, 李 亓, 李佳昊, 周蒙蒙, 杨靖民

( 吉林农业大学 吉林省商品粮基地土壤资源可持续利用重点实验室, 资源与环境学院, 长春 130118)

2-氯-6-(三氯甲基)吡啶(nitrapyrin, CP)是一种白色晶状固体物质.Goring[1]报道了CP具有硝化抑制特性, CP施用到土壤后可显著抑制硝化细菌的活性[2], 延缓铵态氮向硝态氮转化[3-4], 减少氮素的淋溶和温室气体排放[5-7], 从而提高了氮素利用率, 增加了作物产量[8-9].由于使用CP后, 易被土壤吸附而降低其有效性[10-13], 土壤对CP的吸附作用是影响其在土壤环境中有效性的重要因素, 因此建立可同时测定不同类型土壤中CP含量的方法具有重要意义.

高效液相色谱法常用于土壤中有机物的定量分析, 该方法成熟、准确度较高[14-16].张玉敏等[17]研究了甲基吡啶的高效液相色谱分析方法； 王岙等[18]通过液相色谱法同时测定两种农药, 解决了用气相色谱法和质谱法存在保存期短、处理步骤繁琐及二者分离较难的问题.目前多采用高效液相色谱法分析吡啶类物质[19-24], 利用反相色谱柱和极性流动相, 根据不同吡啶类物质在反相柱的吸附力不同进行分离, 不需要高温气化, 测定更易实现.土壤中有机物的提取方法主要包括索氏提取、超声萃取和压力萃取等, 其中索氏提取法提取率较高, 但存在耗时(>16 h)、有机溶剂消耗量大及操作复杂等缺点； 压力萃取需配备专用仪器, 成本较高； 超声波提取操作简单、节能且省时省力[18,25].超声萃取-高效液相色谱分析法操作简单, 成本较低, 由于CP化合物的极性为中性, 沸点较低, 其在土壤中的提取和含量测试方法目前尚未见文献报道.因此本文用超声萃取-高效液相色谱法测定土壤中的CP, 用Agilent SB-C18色谱柱, 优化流动相最佳体积比和最佳流速, 测定不同土壤类型中CP的质量浓度.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(安捷伦1260型, 美国安捷伦公司)： 六通阀进样器、紫外检测器和色谱柱(Agilent SB-C18不锈钢柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm))； 高速冷冻离心机(Z36HK型, 德国HERMLE公司)； 恒温水浴振荡器(SHA-C型, 常州华普达仪器有限公司).CP乳油(质量分数30%, 实验室制备)； CP微囊悬浮剂(质量分数10%, 实验室制备)； 甲醇、乙醇和乙腈(色谱纯, 上海国药集团化学试剂有限公司)； CP原药(质量分数≥98.0%, 上海甄准生物科技有限公司)； CP标准品(质量分数≥99.0%, 德国LGC Labort G-mbH·Bgm公司); 实验用水均为二次去离子水.

1.2 供试土壤

选择草甸黑土、黑钙土和风沙土3种供试土壤.在吉林农业大学农业科学试验站采集草甸黑土； 在吉林省农安县农田采集黑钙土； 在吉林省梨树县农业科学试验站采集风沙土.样品采集地点均为连续多年种植玉米的土地, 且无硝化抑制剂CP的使用记录, 土壤采样深度为0～20 cm, 自然风干, 剔除动植物残体, 过2 mm筛, 于密封袋中保存备用.3种供试土壤的基本性质列于表1.

表1 供试土壤的基本性质

1.3 方 法

1.3.1 流动相条件 参考文献[19]用高效液相色谱法测定氯化产物及产品中CP的质量比.将流动相设为：V(甲醇)∶V(水)=9，V(甲醇)∶V(水)=4，V(甲醇)∶V(水)=7∶3；V(乙腈)∶V(水)=9，V(乙腈)∶V(水)=4，V(乙腈)∶V(水)=7∶3.测定CP标准溶液(50 mg/L)的色谱图.

1.3.2 检测波长 用紫外检测器在190～400 nm内对CP标准溶液(50 mg/L)进行紫外区光谱扫描.

1.3.3 流动相流速 参考文献[19]， 用高效液相色谱法测定氯化产物及产品中CP的质量浓度.考虑土壤浸提液中杂质与CP的分离效果, 将流动相流速分别设为0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 mL/min, 考察不同流速对CP色谱峰峰型和保留时间的影响.

1.3.4 标准曲线制作 用分析纯乙醇和CP标准品分别配制0,2,5,10,20,25,45,75 mg/L的CP溶液, 以CP质量浓度和对应峰面积绘制标准曲线.

1.4 测定方法评价指标

1.4.1 检出限 对空白土壤样品连续进样测定20次, 根据峰面积计算标准偏差, 按

D=3q/S

(1)

计算检出限.其中:D为检出限;q为标准偏差;S为方法的灵敏度, 即回归线方程的斜率.

1.4.2 准确度和精密度

1) 在最佳测定条件下, 对CP标准溶液重复进样10次, 计算标准偏差和变异系数.

2) 在3种土壤(CP无检出)中分别添加低质量浓度(25 mg/L)和高质量浓度(75 mg/L)的CP标准溶液,m(固)∶V(液)=5, 重复3次, 于25 ℃恒温培养箱中培养24 h, 取1.50 g于碘量瓶中, 先分别用15,15,5 mL分析纯乙醇各超声10 min提取土壤中的CP, 再于10 000 r/min离心, 上清液用0.45 μm有机滤膜过滤, 低温(-20 ℃)保存备用.在最佳测定条件下测定不同类型土壤中CP的质量比, 计算标准偏差和变异系数.

3) 选择CP乳油和CP微囊悬浮剂两种剂型, 分别称取土壤10.00 g, 在土壤中分别添加2 mL质量浓度为50 mg/L不同剂型的CP水溶液, 充分混匀, 重复3次, 于25 ℃恒温培养箱中培养24 h, 取1.50 g于碘量瓶中, 先分别用15,15,5 mL分析纯乙醇各超声10 min提取土壤中的CP, 再于10 000 r/min离心, 上清液用0.45 μm有机滤膜过滤, 低温(-20 ℃)保存备用, 在最佳测定条件下测定不同剂型中CP的质量比, 计算标准偏差和变异系数.

1.5 数据处理方法

用SPSS 17.0软件处理数据, 用单因素方差分析法分析差异显著性(Duncan新复极差法,p<0.05), 用Oringe 8.5软件绘制图表, 通过色谱工作站(ChemStation Edition for LC and LC/MS systems, C0.01.05[35])处理数据.

2 结果与讨论

2.1 优化CP测定条件

图1 CP的紫外吸收曲线Fig.1 UV absorption curve of CP

当用色谱法分析吡啶类物质时, 选用C18色谱柱较多[19,21,26].由于高效液相色谱法测定吡啶类物质时的色谱柱类型、流动相、流速和检测波长等均显著影响样品的测定准确度, 因此本文研究不同流动相及不同比例、流动速度和检测波长等因素对CP质量比测定的准确度、精密度和检测限的影响, 并用超声萃取法测定不同类型土壤中的CP质量比.

2.1.1 检测波长的选择 当温度为25 ℃,V(乙腈)∶V(水)=4的溶液为流动相, 流速为0.8 mL/min时, CP标准溶液(50 mg/L)的紫外光谱如图1所示.由图1可见, 在λ=285 nm处有强吸收峰, 为芳香环体系特征吸收峰, 因此在该波长处的检测灵敏度较高, 可作为CP的检测波长.

2.1.2 流动相的选择 当温度为25 ℃, 流动相流速为0.8 mL/min, 检测波长为285 nm时, 不同流动相中CP的高效液相色谱如图2所示.由图2可见: 乙腈明显优于甲醇作为流动相时的分离效果; 当V(乙腈)∶V(水)=4, 保留时间为4.6 min时分离效果较好, 可将乙醇、CP及其他杂质的色谱峰分开且峰形规则, 因此选择V(乙腈)∶V(水)=4为最优流动相.由于不同物质的理化性质不同, 因此对流动相的选择也不同[21-22,25].本文选择的最佳流动相可将CP与其他物质完全分离.

图2 不同流动相的CP色谱Fig.2 Chromatograms of CP in different mobile phases

图3 同一流动相不同流速的CP色谱Fig.3 Chromatograms of CP of same mobile phase at different flow rates

2.1.3 流速的选择 当温度为25 ℃,V(乙腈)∶V(水)=4的溶液为流动相, 流速分别为0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 mL/min时, CP标准溶液(50 mg/L)的色谱如图3所示.由图3可见: 当流动相流速较低(0.4,0.6 mL/min)时, 样品保留时间长, 分离效果好, 但测定时间长； 当流速较高(1.2,1.4 mL/min)时, 样品保留时间短, 但分离效果差, 图谱存在拖尾现象； 当流速为0.8 mL/min, CP保留时间为4.55 min时, 峰形及分离效果较好, 因此选其为最佳流速.

2.2 CP标准曲线

图4 CP标准曲线Fig.4 Standard curve of CP

在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液为流动相, 流速为0.8 mL/min, 检测波长为285 nm条件下, 测定质量浓度分别为0,2,5,10,20,25,45,75 mg/L的CP标准溶液色谱, 以色谱峰面积为纵坐标y, 进样质量浓度为横坐标x, 绘制标准曲线如图4所示.由图4可见, CP的质量浓度与其对应的峰面积呈较好的线性关系(R2=0.999 8,p<0.01).

2.3 检出限

在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液为流动相, 流速为0.8 mL/min, 检测波长为285 nm条件下, 对空白土壤样品连续进样测定20次, 根据峰面积的标准偏差, 按式(1)计算得到检出限为0.42 mg/L, 表明该方法可准确分析土壤中较低质量浓度的CP.

2.4 准确度和精密度

2.4.1 CP准确度和精密度测定 在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液为流动相, 流速为0.8 mL/min, 检测波长为285 nm条件下, 对CP标准溶液(50 mg/L)重复进样10次, 计算标准偏差和变异系数, 结果列于表2.由表2可见, 测定结果具有较好的重复性, 标准偏差和变异系数分别为1.89和0.048, 即该方法测定CP标准溶液具有较高的准确度和精密度.

表2 CP准确度和精密度测定

2.4.2 不同土壤中CP准确度和精确度测定 在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液为流动相, 流速为0.8 mL/min, 检测波长为285 nm条件下, 在3种土壤中测定低质量浓度(25 mg/L)和高质量浓度(75 mg/L)CP的加标回收率, 结果列于表3.由表3可见, 该方法具有较高的准确度和精密度, 可用于草甸黑土、黑钙土和风沙土中CP质量比的测定.

表3 土壤中CP准确度和精确度测定

2.4.3 不同剂型CP在土壤中的准确度和精确度测定 在V(乙腈)∶V(水)=4的溶液为流动相, 流速为0.8 mL/min, 检测波长为285 nm条件下, 不同剂型CP在土壤中质量比测定结果列于表4.由表4可见： CP乳油在草甸黑土、黑钙土和风沙土中的标准偏差分别为2.14,2.68,3.06, 变异系数分别为0.03,0.03,0.04； CP微囊悬浮剂在草甸黑土、黑钙土和风沙土中的标准偏差分别为3.05,3.03,1.34, 变异系数分别为0.04,0.04,0.02.表明该方法可用于不同剂型CP在不同土壤中含量的测定, 具有较高的准确度和精密度.

综上所述, 本文给出了超声萃取-高效液相色谱法测定不同类型土壤中硝化抑制剂CP含量的方法.以乙腈和蒸馏水为流动相, 最佳比例为V(乙腈)∶V(水)=4, 最佳检测波长为285 nm, 最佳流速为0.8 mL/min, 标准曲线线性显著(R2=0.999 8,p<0.01), 检出限为0.42 mg/L.在最佳条件下, 用超声萃取-高效液相色谱法可在4.5 min内分离测定草甸黑土、黑钙土和风沙土中CP的含量, 不同质量浓度和不同剂型CP溶液在草甸黑土、黑钙土和风沙土中添加24 h的回收率为82.44%～91.66%, 标准偏差为1.34～5.04, 变异系数为0.02～0.06.该方法快速简便、精密度和准确度较高, 可用于不同类型土壤中不同剂型硝化抑制剂CP含量的测定.

表4 不同剂型CP在土壤中准确度和精确度测定