红提葡萄不同发酵阶段功能性及抗氧化性研究

田欢，杨丽萍，单春会，蔡文超，杨明君，唐凤仙

(石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000)

红提葡萄(red globe grape)又名红地球、晚红，欧亚种；红提葡萄含有大量的植物化学物质，包括酚类、黄酮类、花色苷及白藜芦醇，因其表现出显著的抗氧化活性，所以对健康非常有益[1,2]。

醋因其具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病等功能特性而备受欢迎[3]。醋不仅是食品调味料的一种成分，也是饮料配方的主要成分。果醋是以新鲜水果或果品加工下脚料为主要原料通过连续酒精发酵和醋酸发酵生产得到的一种酸性液体产品[4,5]。Coelho等[6]对不同水果浓缩物制醋的抗氧化活性和挥发性成分进行对比，发现这些水果醋拥有较高的抗氧化活性。目前市场上已有和已研究的果醋有苹果醋、番茄醋、柿子醋和红枣醋等[7]，但大多都没有产业化应用，而且果醋的品种比较单一，果醋生产过程不够业和细致，造成果醋的营养价值和商业价值没有得到完全体现。

本研究利用功能性成分和抗氧化活性的测定方法，并结合主成分分析，对红提葡萄不同发酵阶段产品的功能性成分和抗氧化活性进行对比分析，为红提葡萄的深加工利用提供参考，对未来食品加工与调味品行业发展具有重要的理论价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红提葡萄采摘自新疆石河子市的一个农场，采摘时红提葡萄完全成熟，由人工采摘选取无病虫害的放置于保鲜袋里，于-20 ℃下冷藏。醋酸菌由石河子大学食品学院果蔬加工实验室保藏。

柠檬酸、柠檬酸钠(食品级)：西安沐森生物工程有限公司；果胶酶、抗坏血酸、偏重亚硫酸钾：北京索宝生物科技有限公司；酿酒活性干酵母：安琪酵母(伊犁)有限公司。

DPPH、ABTS、芦丁：上海源叶生物科技有限公司；没食子酸：成都市科龙化工试剂厂；盐酸、三氯乙酸、三氯化铁、亚硝酸钠、过硫酸钾、水杨酸、铁氰化钾：天津运盛化学品有限公司；碳酸钠、无水乙酸钠：天津市盛奥化学试剂有限公司；氢氧化钠、硫酸亚铁、30%过氧化氢、硝酸铝：武汉荆隆化工有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：天津市福晨化学试剂厂；福林酚：上海麦克林生化科技有限公司；总抗氧化试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；以上所采购的药品均为分析纯。

1.2 仪器与设备

MC202231手持折光仪 四川成都泰华光学有限公司；Multifuge X1R离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司；JP-1000B-2高速多功能粉碎机 浙江久品工贸有限公司；HWS-28电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；酒精计(规格为0～40) 新疆宏道仪器科技有限公司；LDZX-30KBS高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2D超净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司；THZ-98恒温摇床 上海百典仪器设备有限公司；XB3200C分析天平 上海天平仪器厂；ZXSR-1430恒温培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；WD-2102A酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.3 红提原汁的制备

称取定量的红提葡萄清洗晾干，然后用破碎机进行榨汁破碎即得红提原汁。

1.4 红提果酒的制备

对红提原汁添加0.08%抗坏血酸、0.03%果胶酶和0.006%偏重亚硫酸钾；随后进行成分调整，使用白砂糖调整其糖度为24 °Bx，使用柠檬酸钠调整其pH值至4.0；成分调整完成后添加0.03%酿酒活性干酵母进行酒精发酵，22 ℃下发酵5 d；发酵完成后杀菌过滤，即得酒精度为8.6%的红提果酒。

1.5 红提果醋的制备

对红提果酒接种5%经过驯化培养的醋酸菌，然后在35 ℃、160 r/min的恒温摇床下发酵10 d得到醋酸含量为6.65 g/dL的红提果醋。

1.6 理化指标测定

总糖测定：采用直接滴定法[8]；总酸含量(以柠檬酸计)：采用酸碱滴定法。

1.7 功能性成分的测定

1.7.1 维生素C

采用2,6-二氯靛酚法[9]。取适量样品溶液用2%草酸溶液定容至100 mL，过滤备用。取5 mL滤液于用标定的2,6-二氯靛酚溶液滴定至微粉色不褪色。同时用蒸馏水做空白试验。维生素C含量按下式计算：

维生素C含量(mg/100 g)=[(V-V0)/m]×T×100。

式中：V为滴定样品溶液时消耗染料体积；V0为空白时消耗染料体积；m为样品质量；T为1 mL染料相当于抗坏血酸溶液的量。

1.7.2 总酚含量

采用福林酚法，取0.8 mL样品上清液加蒸馏水至10 mL，加入1 mL福林酚，混合均匀避光保存5 min后，加入2 mL 12%碳酸钠溶液，蒸馏水定容至25 mL。室温避光保存90 min，测定765 nm波长吸光度，并根据标准曲线计算样品中总酚含量。以没食子酸为标准品建立拟合回归方程为Y=75.371X+0.0175，相关系数R2=0.9947。总酚含量以没食子酸含量计。

1.7.3 总黄酮含量

取0.5 mL样品溶液加入0.15 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀静置6 min；然后加入0.15 mL 10%硝酸铝溶液，混匀静置6 min；再加入2 mL 4%氢氧化钠溶液；蒸馏水定容至5 mL，混匀静置3 min。测定508 nm波长吸光度。以芦丁标准溶液为标准品建立拟合回归方程Y=16.892X-0.0119，相关系数R2=0.9962。总黄酮含量以芦丁含量计。

1.7.4 总花色苷含量

采用pH示差法[10]，取2.5 mL样品，分别用pH 1的氯化钾-盐酸缓冲液和pH 4.5的乙酸钠-盐酸缓冲液定容至10 mL；避光静置90 min。测定525 nm和700 nm波长处的吸光度。

花色苷含量按下式计算：

A=pH 1(A525-A700)-pH 4.5(A525-A700)。

C=[(A×MW)/(ε×I)]×DF×100。

式中：C为样品中总花色苷含量，mg/dL；MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量449.2；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷摩尔消光系数26900；I为比色皿光程；DF为稀释因子。

1.8 抗氧化活性的测定

1.8.1 总抗氧化能力

总抗氧化能力采用FRAP法[11]，取5 μL样品溶液与180 μL FRAP工作液混合，于37 ℃孵育5 min。测定593 nm波长处的吸光度值。以硫酸亚铁标准溶液建立拟合回归方程为Y=0.1949X-0.0073，相关系数R2=0.9934。总抗氧化能力以硫酸亚铁含量表示。

1.8.2 DPPH自由基清除能力

取3支试管，第一支试管加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH工作液与1 mL样品溶液；第二支试管加入1 mL无水乙醇与1 mL样品溶液；第三支试管加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH工作液与1 mL无水乙醇。振摇，避光静置30 min，取上清液于517 nm波长测定吸光度[12]。DPPH自由基清除率按下式计算：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中：A1为第一支试管的吸光度值；A2为第二支试管的吸光度值；A3为第三支试管的吸光度值。

1.8.3 ABTS+自由基清除能力

取3支试管，第一支试管加入0.8 mL ABTS+工作液与0.2 mL样品溶液；第二支试管加入0.8 mL无水乙醇与0.2 mL样品溶液；第三支试管加入0.8 mL ABTS+工作液与0.2 mL无水乙醇。振摇后静置6 min，取上清液在波长734 nm处测定吸光度[13]。ABTS+自由基清除率按下式计算：

ABTS+自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中：A1为第一支试管的吸光度值；A2为第二支试管的吸光度值；A3为第三支试管的吸光度值。

1.8.4 羟自由基清除能力

取3支试管，第一支试管依次加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液，1 mL样品溶液，1 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液，1 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液；第二支试管依次加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液，1 mL样品溶液，1 mL蒸馏水，1 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液；第三支试管依次加入1 mL 9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液，1 mL蒸馏水，1 mL 9 mmol/L硫酸亚铁溶液，1 mL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液。混合均匀后取上清液与于510 nm处测定吸光度[14]。羟自由基清除率按下式计算：

羟自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100。

式中：A1为第一支试管的吸光度值；A2为第二支试管的吸光度值；A3为第三支试管的吸光度值。

1.8.5 还原能力

取1支试管，依次加入1 mL样品溶液，0.2 mL pH 6.6的PBS缓冲液(0.2 mol/L)，0.5 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃恒温放置20 min；加入1 mL 10%三氯乙酸，4000 r/min离心10 min；取1.5 mL上清液加入0.2 mL 1%的三氯化铁溶液，3 mL蒸馏水；混匀静置5 min。测定700 nm波长处的吸光度值[15]。

1.9 数据分析

每项试验指标至少平行测定3次，试验结果用平均值±标准误差表示，采用SPSS 19.0进行数据处理，采用Origin 9.0 绘图。

2 结果与分析

2.1 理化指标测定结果

图1 红提原汁、果酒和果醋中总糖和总酸的变化Fig.1 The changes of total sugar and total acid in red grape juice, fruit wine and fruit vinegar

由图1可知，在红提果汁至红提果酒阶段，总酸含量上升，这可能是由于发酵时期酵母菌发挥作用产生有机酸，导致总酸含量上升[16]，在红提果酒至红提果醋阶段，总酸含量呈现上升的趋势，可能是红提果酒在醋酸发酵的过程中由于醋酸菌作用将乙醇氧化为乙酸，导致总酸含量上升[17]。在酒精发酵及醋酸发酵阶段总糖含量呈现下降趋势，这是因为酒精发酵阶段，糖是酵母菌生长繁殖必要营养物质，酵母菌将糖转换为乙醇从而导致总糖含量减少[18]，醋酸发酵阶段，醋酸菌利用乙醇产乙酸，部分糖也会被利用产生乙酸[19]。

2.2 不同发酵阶段的色度变化

图2 红提原汁、果酒和果醋色度的变化Fig.2 The changes of chromaticity of red grape juice, fruit wine and fruit vinegar

由图2可知，发酵样品的L*、a*、b*之间都存在着明显的差异，说明在不同发酵阶段，发酵液中的呈色物质在发生着变化，而这种呈色物质主要是花色苷、单宁和酚类物质，其中L*和a*的变化是与花色苷含量密切相关的， L*和a*的这种变化可能是由于发酵液的花色苷含量变化所引起的，L*和a*的变化与花色苷之间呈负相关[20]；由图中花色苷含量的变化趋势也能证明此相关性。此外，酒精发酵阶段发生呈色物质的变化可能是由于酵母菌的作用导致发酵液中花色苷和酚类物质的变化；醋酸发酵过程中，由于醋酸菌为好氧菌，发酵过程中需要不断的通入氧气，而醋液中含有许多单宁和酚类物质，这些物质被氧化导致红提果醋的a*增加。

2.3 不同发酵阶段的功能性成分变化

图3 红提原汁、果酒和果醋功能成分特征雷达图Fig.3 The radar chart of functional components of red grape juice, fruit wine and fruit vinegar

注：TAC表示总花色苷，TFC表示总黄酮，TPC表示总酚，VC表示维生素C。

由图3可知，VC含量的变化为红提果酒>红提原汁>红提果醋，TAC含量的变化为红提原汁>红提果酒>红提果醋，TPC含量的变化为红提果醋>红提果酒>红提原汁，TFC含量的变化为红提果醋>红提原汁>红提果酒；在酒精发酵阶段TAC含量出现下降趋势，这可能是由于酒精发酵对花色苷产生影响，在酒精发酵前期酵母菌处于增值阶段，这时葡萄皮中的花色苷浸出物较多，在发酵后期酵母菌消耗糖类产生乙醇，同时酵母菌自身也会产生代谢物，这种酵母代谢物与花色苷相互作用导致花色苷含量发生变化[21]，在醋酸发酵阶段TFC与TPC含量上升，VC与TAC含量下降，这可能是因为在发酵过程中TFC、TPC不断地水解浸出导致含量升高，而VC是热敏性活性成分，酒精发酵结束杀菌作用导致VC分解，且VC与TAC均有光敏性，在醋酸发酵过程中也在分解损失，导致VC与TAC含量减少。

2.4 不同发酵阶段的抗氧化能力

表1 红提原汁、果酒和果醋的抗氧化活性Table 1 The antioxidant activities of red grape juice, fruit wine, fruit vinegar

注：TAOC为总抗氧化能力，·OH为羟自由基清除率，RP为还原能力。

由表1可知，TAOC、ABTS+自由基清除能力、·OH自由基清除率及RP随着发酵程度的深入都表现为上升趋势，其中TAOC、·OH、RP变化趋势都表现出较显著的差异性(P<0.05)，且都随发酵程度的深入表现出增高的趋势，ABTS+自由基清除率变化趋势无明显差异(P>0.05)，DPPH自由基清除率在发酵不同阶段略有所下降，但依然有很高的清除能力。

2.5 功能性成分与抗氧化能力的相关性分析

图4 红提原汁、果酒和果醋功能成分及抗氧化性主成分分析图Fig.4 The principal component analysis diagrams of functional components and antioxidant activities of red grape juice, fruit wine, fruit vinegar

基于上述实验结果，运用PCA揭示不同加工阶段中产品品质、功能性成分及抗氧化能力的变化。图4中(a)、(b)分别为因子载荷图和因子得分图。通过PCA发现，不同加工阶段的红提果醋整体信息主要集中在前两个主成分，累计方差贡献率为86.93%，其中第一主成分(PC1)的方差贡献率为68.44%，第二主成分(PC2)的方差贡献率为18.49%。

由图4 中(a)可知，PC1主要由DPPH、TAC、ABTS+及TA等10个指标构成，PC2主要由VC、L*等4个指标构成。其中PC1指标主要分布在第二象限， TPC与RP等指标在空间排布上较近，形成了聚类，代表它们之间存在着正相关关系；TA与TS指标在空间排布上距离最远，说明它们之间存在着负相关关系。

由图4中(b)可知，果汁样品分布在第三象限，果酒分布在第一象限，果醋分布在第四象限，说明酵母菌与醋酸菌的发酵对产品理化指标、功能性成分以及抗氧化能力有着明显的影响。结合图4中(a)可得，果汁TAC指标高，果酒VC指标高，果醋TFC指标高，这与2.3分析结果一致。另外，从空间排布上来看，相较于果汁，果酒和果醋样品呈现出更为明显的分离趋势，说明酵母菌与醋酸菌的发酵赋予了产品更丰富的品质变化。

由图4中(a)的因子载荷图可知，红提原汁、果酒、果醋分布在不同的区域，说明在红提发酵的不同阶段之间的功能成分含量及抗氧化能力相差较大。在图4中(a)分析基础上，对3个样品的功能成分与抗氧化性进行进一步分析得到图4中(b)。

由图4中(b)可知，PCA模型中PC1(68.44%)和PC2(18.49%)累计方差贡献率为86.93%，能够反映大部分信息。由图4中(b)和图4中(a)可知，红提原汁附近主要聚集了TS、a*、b*、TAC、DPPH；红提果酒附近聚集了L*、VC；红提果醋附近聚集了ABTS+、·OH、TAOC、RP、TPC、TFC及TA，这说明红提果醋整体抗氧化能力>红提原汁>红提果酒，与之前的分析结果一致。

3 结论

本研究通过功能性成分和抗氧化活性的测定，结合主成分分析，对红提原汁、果酒及果醋的相关指标差异分析可知：红提葡萄在不同的发酵阶段的功能性成分具有很大的差异，红提原汁的维生素C 的含量较高，红提果酒的花色苷含量较高，红提果醋的总酚和总黄酮的含量较高，造成这种差异主要是由于不同菌种的作用所导致的；抗氧化活性方面红提果醋比红提果汁和果酒的较高。

本研究对红提葡萄的不同发酵阶段进行了对比分析，确定不同发酵阶段产品之间的相关性差异分析，为红提葡萄相关产品的成分分析提供了参考，同时为其深加工利用提供了依据。对食品原料不同加工阶段的品质变化提供了理论依据。