基于近红外光谱扫描技术对高粱中粗脂肪、粗纤维、粗灰分含量的测定方法研究

王勇生 李 洁 王 博 张宇婷 耿俊林

(北京市畜产品质量安全源头控制工程技术研究中心1，北京 102209) (中粮营养健康研究院有限公司2，北京 102209) (中粮生物科技(北京)有限公司3，北京 102209)

高粱是继水稻、小麦、玉米和大麦之后的全球第五大粮食作物(粮农组织，2015年)[1]，主要生长在相对较热和干燥的气候环境条件下。中商情报网报道，2015/2016年度(6月至次年5月)全球高粱产量预计为6 840万t，远高于上年的6 390万t。随着全球变暖和全球粮食产量的下降，高粱已经成为人类食品和动物饲料原料中不可缺少的资源。2016年我国高粱产量接近300万t，进口量670万t，总体上国内高粱进口和出口均呈上升趋势[2]。在畜禽养殖业中猪[3-5]、肉鸡[6]、鸭[7]及反刍动物生产[8,9]中，高粱越来越多地得到了使用以减少饲料的成本。

近红外光谱技术法(NIRS) 具有无损、快速等优点，已被广泛应用于不同的科学研究领域[10-13]，成为了不可或缺的快速准确的测定方法。玉米[14]、小麦[14]、豆粕[15]、棉粕[16]等饲料原料中营养成分的近红外检测方法已有报道，而高粱营养成分的近红外分析方法鲜见报道。实验室采用化学方法对高粱营养价值进行评估，耗费时间长、操作步骤多，而且不能实现现场或实时监测的快速检测需要，尤其对高粱贸易采购环节中的营养价值进行评估极不便利。因此，面对高粱在饲料中大量应用的现状，急需建立针对高粱营养成分进行近红外检测的方法。本研究将基于近红外光谱扫描技术探索建立高粱粗脂肪、粗纤维、粗灰分快速检测模型，以便实现饲料加工企业在高粱采购和应用过程中对粗脂肪、粗纤维、粗灰分指标的快速评估，更好的服务于饲料加工企业。

1 材料与方法

1.1 样品采集与处理

采集来自于国内不同地区及美国、巴西等不同来源的高粱样品110份。使用旋风磨(Retsch ZM200型，德国) 粉碎，过1.0 mm标准筛。粉碎后每个样品采用四分法分为2个重复，装入自封袋中，干燥避光处存放，并尽快对粉碎的样品进行近红外光谱扫描, 同时利用湿化学方法测定粗脂肪、粗纤维、粗灰分含量。

1. 2 湿化学分析

粗脂肪、粗纤维、粗灰分分别采用GB/T 6433—2006、SN/T 0800.8—1999、GB/T 6438—2007测定。

1.3 近红外光谱扫描

利用本实验室设备Bruker Tang-R型(德国)近红外光谱仪采集样品的近红外漫反射光谱。为了尽可能在宽的谱区来扫描收集样品的近红外光谱，本实验光谱扫描范围设置为4 000～12 800 cm-1，分辨率16 cm-1，扫描64次获得平均光谱。样品重复装样扫描4次，取4次扫描光谱作为样本的原始光谱。

1.4 NIRS模型的建立与验证

定标集和验证集样品划分:将样品按7∶3的比例随机分为定标集和验证集，其中验证集样品化学值均在定标集样品化学值的范围内。

定标模型评价指标:根据相对分析误差(RPD)值对模型进行评价。当RPD≥3，说明定标效果良好，建立的定标模型可以用于实际检测，如果2.5≤RPD<3.0，说明利用近红外光谱扫描对该成分进行定量分析是可行的。如果RPD< 2.5，则说明该成分不适合进行NIRS定量分析[17-19]。

交互验证集相对分析误差(RPDCV)计算公式为: RPDCV=样品集标准差/定标集标准偏差；

验证集相对分析误差(RPDV)计算公式为：RPDV=样品集标准差/验证集标准误差。

2 结果与分析

2.1 高粱中粗脂肪、粗纤维、粗灰分的含量测定

高粱中粗脂肪、粗纤维、粗灰分含量测定结果见表1。为了降低湿化学测定误差，同时也为了保证近红外分析的准确性，110份样品的粗蛋白、水分分别由同一实验员进行操作，并保证检测时实验室环境温度的稳定性和仪器设备校准方法的一致性等。

表1 高粱中粗脂肪、粗纤维及粗灰分含量的测定结果

2.2 高粱样品近红外反射光谱及光谱预处理

高粱样品近红外扫描原始光谱图见图1。粗脂肪、粗纤维、粗灰分光谱预处理参数见表2，预处理模型分别为二阶导数、一阶导数+多元散射校正与二阶导数。优化的预处理方法按照定标集交互验证标准误差(RMSECV)的大小排序，RMSECV数值越小越好，选择RMSECV最小数值的模型作为最优的预处理模型。

图1 高粱样品近红外反射光谱图

表2 粗脂肪、粗纤维、粗灰分指标的光谱优化预处理结果

指标外部验证标准误差光谱范围/cm-1预处理模型粗脂肪0.3257 500.3～5 443.6二阶导数粗纤维0.3124 603～4 243.9一阶导数+多元散射校正粗灰分0.1097 500.3～5 443.6二阶导数

2.3 近红外光谱模型的确立和验证

经过OPUS定量方法建立了高粱中粗脂肪、粗纤维、粗灰分的近红外光谱检测定标模型。定标参数及验证结果如表3。粗脂肪含量预测模型交互验证相对分析误差(RPDCV)为3.93，大于评估值3.0；外部验证相对标准差(RPDV)值为2.57，大于评估值2.5，说明所建立的模型可用于日常监测。粗灰分含量预测模型交互验证相对分析误差(RPDCV)为2.37，小于评估值3.0；外部验证相对标准差(RPDV)值分别为2.34，小于评估值2.5；模型相对分析误差(RPD)与评估值相对接近，说明模型存在完善的可能性。粗纤维预测模型交互验证相对分析误差(RPDCV)和外部验证相对标准差(RPDV)值分别为1.47、1.23，与评估值差距较大，模型进一步完善的可能性较低。

表3 高粱中粗脂肪、粗纤维、粗灰分模型的定标和交互验证效果

3 讨论

近红外光谱扫描技术应用于饲料原料中的粗脂肪、粗纤维及灰分的检测在玉米、豆粕、DDGS等原料中已有报道。因原料、建立的方法、检测评估的效果不同，导致一些方法评估效果很好，而一些效果不理想，并不适合于日常的检测应用。李军涛[14]利用近红外反射光谱快速评定了玉米营养价值。玉米中酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、淀粉的定标决定系数为0.86～0.95，交互验证决定系数为0.83～0.93，RPDCV为2.58～3.67，取得了理想的定标效果。而粗灰分的定标效果不理想。粗脂肪、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维的定标决定系数和相对分析误差分别为分别为0.85～0.91和2.67～3.20，其定标方程具有良好的预测性能，可用于日常检测，但粗灰分、淀粉的外部验证结果不理想，暂不能用于日常分析。王燕妮等[20]研究了以玉米、豆粕和棉粕等8 种饲料原料样品其粗蛋白、粗脂肪、粗纤维的独立定量模型和针对所有样品的通用近红外光谱定量分析模型。玉米和杂粕中粗纤维、粗脂肪及粗蛋白的近红外检测模型中验证集均方根误差分别为2.027、2.193、12.509、4.941和12.509、4.941，表明粗蛋白的预测结果最好，粗纤维和粗脂肪的预测结果也可以满足分析要求。沈广辉等[21]报道了基于在线近红外光谱快速检测玉米籽粒主要品质参数的研究，表明粗蛋白在线近红外定量分析模型效果较好；粗灰分的定量模型效果较差，需要进一步优化。熊利华[22]研究了近红外光谱法快速检测茶叶中粗纤维、水分和灰分的方法。粗纤维校正集、验证集相关系数分别为0.954 3、0.962 3，相对分析误差分别为3.49，3.56；粗灰分校正集、验证集相关系数分别为0.981 5、0.983 8，相对分析误差分别为3.49、3.17，相对分析误差均大于3，模型预测精度较高。

近红外光谱技术应用于饲料检测中，Williams等[18]指出当RPD≥3.0时，模型可用于农产品的质量分析。Chen等[17]指出，当RPDV≥3.0时，定标模型能精确预测相关成分含量；当2.0≤RPDV≤3.0时，定标模型的预测效果可用于大量样品的筛选工作；当RPD<2.0时，定标模型的预测效果不理想。本研究中粗脂肪含量预测模型RPDCV值为3.93，大于评估值3.0；RPDV值为2.57，大于评估值2.5，说明所建立的模型可用于日常监测。粗纤维、粗灰分含量预测模型RPDCV分别为1.47、2.37，小于评估值3.0；RPDV值分别为1.23、2.34，小于评估值2.5，说明建模效果不理想。

影响近红外光谱分析结果准确的因素，主要包括仪器和样品方面。测定仪器的稳定性会引起测定的误差，如仪器的噪声、基线的飘逸、标准物校正的准确性、波长的准确性等。样品方面主要有定标样品分布、来源、数量、物理性状及化学分析值的准确性和范围。样品物理性状包括粒度、水分含量、颜色及杂质含量。如水分对近红外分析结果产生影响主要表现为样品的水分含量显著地影响粉碎后颗粒度的大小、形状及其分布，导致样品光谱散射系数S发生变化，从而影响其预测结果；通过与其他成分的水合作用，导致某成分最佳波长点发生漂移[23]。定标集样品应该在非常广的区域内进行选择，一定要有代表性, 也就是说定标样品从待测组分含量，样品水分含量到样品来源等都要代表待测集这个大的群体。化学数值测定方面的误差要尽可能地小，且样品化学值的数值范围要宽。本实验中共采集110份样品，国外包括美国、巴西，国内样品在云南、四川、宁夏等地都有收集。在实验过程中仪器方面严格按照操作流程进行操作，样品测试前进行准确的校正，并保证实验室内温度的稳定。在样品光谱扫描前的粉碎和扫描过程中，以及不同化学指标的测定过程中均由同一人进行操作，尽最大可能减少误差的产生。研究结果表明粗纤维的定标模型RPD值大于评估值，可以用于检测，但在实际应用中还需要对测定的样品进行数据的分析，以实现更加精确的检测；粗纤维和粗灰分效果不理想，原因可能与粗纤维和粗灰分的组成成分相关外，还在于样品的代表性方面以及湿化学值范围不宽有关。因此，下一步需要继续采集样品以进一步完善模型。

4 结论

高粱籽实中粗脂肪、粗纤维、粗灰分的近红外扫描光谱交互验证集RPD值分别为3.93、1.47与2.37；外部验证集RPD分别为2.57、1.23与2.34。粗脂肪预测模型交互验证相对分析误差大于评估值3.0；外部验证相对标准差大于评估值2.5，其预测模型可用于实际的应用；而粗纤维和粗灰分的RPD值分别小于评估值，模型需要进一步完善。