表没食子儿茶素没食子酸酯对米糠蛋白结构和功能性质的影响

苗向硕 吴 伟 吴晓娟

(中南林业科技大学食品科学与工程学院;稻谷及副产物深加工国家工程实验室,长沙 410004)

米糠是糙米碾白产生的主要副产物，米糠含有11%～17%的米糠蛋白。米糠蛋白氨基酸比例合理、过敏性低、生物效价和消化率高，是一种优质新型植物蛋白源，可应用于多种食品中，如婴幼儿食品、烘焙食品、肉制品、饮料、奶、咖啡、糖果等[1]。

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶中已知的最主要的活性酚类物质，具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎等生理活性作用[2]。EGCG不仅能提高食品的营养价值，还能减少食品中稳定剂、着色剂和防腐剂的使用，其作为一种优良的食品添加剂在食品工业中的应用前景十分广阔。在食品的生产加工过程中，EGCG难免会与蛋白接触，EGCG可以通过疏水相互作用、氢键和范德华力等与蛋白形成复合物[3-5]，进而影响蛋白的结构和功能性质。因此近年来蛋白质与EGCG的复合对蛋白结构与功能性质的影响成为研究热点。付珊琳等[3]研究表明EGCG使去折叠β乳球蛋白的二级和三级结构变化。Al-Hanish 等[6]研究发现 EGCG使α-乳清蛋白的二级结构改变。胡思等[7]研究发现茶多酚的加入显著降低了面筋蛋白的溶解度和起泡性。刘泽宇等[8]研究发现添加茶多酚能显著提高草鱼鱼肉蛋白质的乳化稳定性，并延缓乳化能力的降低。而对于米糠蛋白与EGCG的复合对蛋白结构和功能性质的影响鲜见研究。

由于在高温和碱性条件下，EGCG很不稳定，容易裂解以及被氧化成不需要的副产物，如醌类化合物[5]。因此，本研究将不同比例的EGCG与米糠蛋白在常温中性条件下进行反应，研究EGCG对米糠蛋白结构和功能性质的影响，对于EGCG等天然酚类物质在富含米糠蛋白食品生产加工中的应用提供了一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂米糠、表没食子儿茶素没食子酸酯(纯度≥98%)、5,5′-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、1-苯氨基萘-8-磺酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Sorvall LYNX 6000高速落地离心机；FD5-4冷冻干燥机；F4600 荧光分光光度计；Blue Star紫外可见分光光度计；LC-20 液相色谱仪；IRTracer-100傅里叶红外光谱仪。

1.3 方法

1.3.1 米糠蛋白提取

参考吴伟等[9]的方法提取米糠蛋白。将脱脂米糠和去离子水以1∶10(g∶mL)混合，用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下搅拌提取4 h，随后以8 000 r/min在4 ℃下离心20 min，取上清液用2 mol/L HCl调pH至4.0，静置20 min后在4 ℃条件下以8 000 r/min离心20 min得到米糠蛋白沉淀，水洗米糠蛋白沉淀3次后将沉淀分散于5倍体积的去离子水中，用2 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，冷冻干燥得到纯度为92.81%(干基)的米糠蛋白。

1.3.2 米糠蛋白总巯基含量的测定

采用DTNB比色法测定米糠蛋白的总巯基含量[5]。将0.25 g米糠蛋白溶于50 mL 8 mol/L尿素Tris-Gly溶液中，分别加入不同量EGCG(EGCG:米糠蛋白质量比为0∶1，0.05∶1，0.1∶1，0.15∶1，0.2∶1，0.5∶1，1∶1，)，搅拌30 min，在25 ℃下静置反应2 h，10 000 r/min离心15 min，取上清液用考马斯亮蓝比色法测定溶液中蛋白质含量。取4 mL蛋白质溶液加入0.2% β-巯基乙醇处理2 h 后，再加入 8 mL 12%的三氯乙酸沉淀蛋白质1 h，在10 000 r/min离心10 min，用三氯乙酸溶液重复洗涤沉淀3次后，将沉淀溶于6 mL Tris-Gly 缓冲液中，加入240 μL DNTB，在412 nm波长下测定吸光度，以摩尔消光系数13 600 L/(mol·cm)计算总巯基含量。

1.3.3 米糠蛋白傅里叶红外光谱酰胺Ⅰ带的测定

将米糠蛋白溶于0.02 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，最终米糠蛋白浓度为1 mg/mL，加入不同量的EGCG(同1.3.2)混合，搅拌30 min，在25 ℃下静置反应2 h，然后冷冻干燥成粉末。在室温、干燥环境下，分别将2 mg米糠蛋白和EGCG改性的米糠蛋白样品与200 mg KBr研磨混合均匀后压片5 min制成透明薄片，采用傅里叶红外测定仪进行扫描。扫描波数范围：400～4 000 cm-1，分辨率：4 cm-1，扫描次数：64。

1.3.4 米糠蛋白表面疏水性的测定

采用1-苯氨基萘-8-磺酸作为荧光探针法测定米糠蛋白的表面疏水性[5]。将0.45 g米糠蛋白溶于30 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入不同量EGCG (同1.3.2)，搅拌30 min，在25 ℃下静置反应2 h，采用考马斯亮蓝比色法测定溶液中蛋白质含量，并将蛋白质溶液稀释为蛋白浓度在0.005～0.50 mg/mL之间5个不同浓度梯度。取不同蛋白浓度溶液4 mL，分别加入50 μL 8 mmol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸溶液，在激发波长390 nm、发射波长470 nm处测定荧光强度。以荧光强度对蛋白质浓度作图，曲线初始阶段的斜率即为米糠蛋白的表面疏水性指数。

1.3.5 米糠蛋白内源荧光光谱的测定

在10 mL试管中加入2 mL浓度为1.5 mg/mL 米糠蛋白溶液，加入梯度体积的3 mg/mL的EGCG溶液，后加入pH 7.0的0.02 mol/L 的磷酸盐缓冲液定容至3 mL，最终米糠蛋白浓度为1 mg/mL，得到质量比为0∶1，0.05∶1，0.1∶1，0.15∶1，0.2∶1，0.5∶1，1∶1(EGCG∶米糠蛋白)的混合液，搅拌30 min，然后选择激发波长为290 nm，发射波长为300～500 nm，激发和发射的狭缝宽度分别为5 nm和10 nm ，扫描速度1 200 nm/min的条件下测定荧光光谱。

1.3.6 米糠蛋白相对分子质量分布的测定

将米糠蛋白分散于0.05 mol/L磷酸盐缓冲液中(pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl)，配制成蛋白浓度10 mg/mL的溶液，分别加入不同量的EGCG，使得EGCG浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、5、10 mg/mL，此时EGCG与米糠蛋白的质量比分别为0∶1、0.05∶1、0.1∶1、 0.15∶1、 0.2∶1、0.5∶1、1∶1。搅拌30 min，在25 ℃下静置反应2 h，随后过孔径0.45 μm的醋酸纤维素膜，收集滤液。采用LC-20A高效液相色谱仪对样品进行分析，色谱柱：TSKgel SW G4000 SWXL；检测器：Waters 996光电二极管阵列检测器；流动相：0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2，含0.05 mol/L NaCl)；检测波长：280 nm；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃。

1.3.7 米糠蛋白凝胶电泳分析

浓缩胶质量分数4%，分离胶质量分数12.5%；电极缓冲液含0.1%十二烷基硫酸钠(pH 8.3)，0.384 mol/L Gly，0.05 mol/L Tris；样品溶解液为0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液，含2%十二烷基硫酸钠，10%甘油，0.02%溴酚蓝，5% β-巯基乙醇；样品浓度1.5 mg/mL，上样量10 μL。电泳采用0.75 mm凝胶板，开始时电流为10 mA，样品进入分离胶后调为25 mA。

1.3.8 米糠蛋白溶解性的测定

将0.50 g米糠蛋白样品分散于50 mL去离子水中，加入不同量EGCG(同1.3.2)，搅拌30 min，在25 ℃下静置反应2 h，室温条件 10 000 r/min 离心 20 min 收集上清液。随后采用微量凯氏定氮法测定上清液中可溶解氮含量，蛋白质溶解性表示为可溶解氮与样品中总氮的百分比。

1.3.9 米糠蛋白持水性的测定

预先称重离心管的质量m1，准确称取200 mg米糠蛋白m2，加入不同量EGCG(同1.3.2)m3，加入10 mL去离子水在离心管中混合，用涡流振荡器混合搅拌均匀。然后在3 000 r/min离心20 min，轻轻倒出上清液避免损失蛋白质，称总质量m4，米糠蛋白持水性表示为吸收水的质量占样品的质量的百分比，计算公式如下：

1.3.10 米糠蛋白持油性的测定

预先称重离心管的质量M1，准确称取200 mg米糠蛋白M2，加入不同量EGCG(同1.3.2)M3，加入15 mL大豆油在离心管中混合，用涡流振荡器混合搅拌均匀，3 000 r/min离心20 min，倒出上清液后称总质量M4。米糠蛋白持油性表示为吸收油的质量占样品的质量百分比，计算公式如下：

1.3.11 米糠蛋白起泡能力和泡沫稳定性的测定

准确称取米糠蛋白200 mg溶于20 mL 0.05 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，加入不同量的EGCG(同1.3.2)，充分混合后使用高速均质机以10 000 r/min均质30 s，重复3次，测量均质后的体积V0，静置30 min后测量泡沫体积V30，米糠蛋白的起泡能力和泡沫稳定性计算公式如下：

1.3.12 米糠蛋白乳化性和乳化稳定性的测定

准确称取米糠蛋白200 mg溶于去离子水中，配置1 mg/mL的米糠蛋白溶液，在米糠蛋白溶液中加入不同量EGCG(同1.3.2)，取12 mL蛋白溶液和4 mL大豆油混合。然后采用高速均质机以10 000 r/min均质2 min，取20 μL米糠蛋白-大豆油乳状液与5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠用涡流振荡器混合均匀，在500 nm处测定吸光度。米糠蛋白的乳化性和乳化稳定性计算公式如下：

式中：N表示稀释倍数；C表示样品溶解液中蛋白质浓度；φ表示油相所占的分数。

1.3.13 数据分析

所有实验平行测定3 次。采用Microsoft Excel 2010和Origin Pro 8处理数据和绘制图形。结果用平均值±标准差的形式表示。指标比较采用最小显著差异法，取95%置信度(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 EGCG对米糠蛋白总巯基含量的影响

加入不同比例EGCG米糠蛋白的总巯基含量如图1所示。随着EGCG添加比例的增大，总巯基含量由41.26 nmol/mg 逐渐降低至25.99 nmol/mg。在研究儿茶素与黄笛鲷肌原纤维蛋白相互作用以及EGCG与乳清蛋白相互作用的文献中，也同样发现随着儿茶素和EGCG添加浓度的增加，黄笛鲷肌原纤维蛋白和乳清蛋白总巯基含量逐渐下降[5,10]。EGCG可使得蛋白质巯基去质子化形成硫醇离子(RS-)，蛋白质半胱氨酸残基中的硫醇基团活性很强，很容易与EGCG结合，从而导致蛋白质总巯基含量下降[5]。

图1 EGCG对米糠蛋白总巯基含量的影响

2.2 EGCG对米糠蛋白二级结构的影响

图2 EGCG对米糠蛋白去卷积酰胺Ⅰ带的影响

表1 EGCG对米糠蛋白二级结构含量的影响

蛋白二级结构波数/cm-1组成/%对照0.050.10.150.20.51氨基酸侧链1 609～1 6123.113.643.644.044.676.668.65β-折叠1 618～1 6204.925.276.396.516.548.7210.25β-折叠1 626～1 6329.868.829.6310.7210.0813.0914.54β-折叠1 638～1 64113.2113.5313.1512.8412.0713.5613.27无规卷曲1 646～1 64913.6113.4614.2214.6914.4713.2611.44α-螺旋1 653～1 65718.8218.0217.9817.2517.0515.6014.57无规卷曲1 662～1 66716.7616.7016.5916.1516.8414.3312.50β-转角1 670～1 67812.4312.6710.9811.1410.858.788.88β-折叠1 687～1 6927.287.897.426.667.456.005.91α-螺旋总量18.8218.0217.9817.2517.0515.6014.57β-折叠总量35.2735.5036.5836.7236.1341.3743.97β-转角总量12.4312.6710.9811.1410.858.788.88无规卷曲总量30.3730.1630.8130.8431.3127.5923.93氨基酸侧链总量3.113.643.644.044.676.668.65

2.3 EGCG对米糠蛋白表面疏水性的影响

加入不同比例EGCG的米糠蛋白表面疏水性如图3所示。随着EGCG添加比例的增大，米糠蛋白表面疏水性由903.21下降到41.58。在EGCG与乳清蛋白[5]、大豆分离蛋白[14]和去折叠态β-乳球蛋白[3]相互作用时也发现，随着EGCG添加比例的上升，这几种蛋白质表面疏水性都逐渐下降。EGCG分子含有多个羟基，EGCG可与蛋白质通过疏水作用结合形成复合物，一方面降低蛋白质表面疏水性氨基酸残基的数量，另一方面增加蛋白质表面的亲水性[5, 14]；此外，EGCG还可导致蛋白质构象发生变化，使蛋白质中的一些疏水基团埋藏在分子内部[15]，这些因素都可导致蛋白质表面疏水性下降。

图3 EGCG对米糠蛋白表面疏水性的影响

注：米糠蛋白质量浓度为1 mg/mL；1～7 ：EGCG质量浓度分别为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.5、1 mg/mL；温度为298 K。图4 EGCG对米糠蛋白内源荧光光谱的影响

2.4 EGCG对米糠蛋白荧光光谱的影响

加入不同比例EGCG的米糠蛋白荧光光谱如图4所示，随着EGCG添加比例的增加，米糠蛋白的荧光强度明显下降，最大发射峰从360.2 nm逐渐红移至 396.2 nm。EGCG与α-乳清蛋白[6]、β-酪蛋白[15]、猪肌原纤维蛋白[16]相互作用时蛋白质内源荧光也出现了类似现象。内源荧光强度快速下降说明EGCG可导致米糠蛋白内源荧光淬灭，表明EGCG与米糠蛋白色氨酸残基之间存在较强的相互作用[14,16]。

表2 EGCG对米糠蛋白分子质量分布的影响

此外，内源荧光光谱中最大荧光峰位红移表明米糠蛋白中色氨基酸残基微环境由疏水性逐渐向亲水性转变，米糠蛋白多肽空间结构逐渐处于更加延伸的状态[17]。

2.5 EGCG对米糠蛋白分子质量分布的影响

天然以及经EGCG处理的米糠蛋白的分子质量分布如表2所示。未加入EGCG的米糠蛋白分子质量分布图呈现2个吸收峰，对应的保留时间分别为11.66、12.09 min。吴伟等[18, 19]制备的米糠球蛋白和谷蛋白在类似的高效液相色谱条件下保留时间分别为10.81 min和11.35 min，由于制备米糠蛋白的原料和工艺不同，米糠蛋白各组分的含量和出峰时间略有差异，由此推断保留时间为11.66 min的吸收峰可能是相对分子质量较大的球蛋白、清蛋白以及蛋白聚集体，保留时间为12.09 min的吸收峰可能是相对分子质量较小的谷蛋白和醇溶蛋白。当EGCG和米糠蛋白的质量比为0.1∶1时，在保留时间5.58 min处新增一个吸收峰，此吸收峰对应的蛋白质分子质量在1 000 ku左右，为蛋白质高分子质量聚集体；当EGCG和米糠蛋白的质量比为0.15∶1时，在保留时间10.73 min 处新增一个吸收峰，此吸收峰对应蛋白质低分子质量聚集体。随着EGCG添加比例进一步增大，蛋白质低分子质量聚集体先增加后减少，高分子聚集体持续增加，表明EGCG与米糠蛋白相互作用时主要导致的是蛋白质交联聚集。当EGCG和米糠蛋白的质量比为0.5∶1时，保留时间19.17 min呈现较大的吸收峰，此吸收峰对应游离态的EGCG[3]，表明EGCG与米糠蛋白的结合已经达到饱和。

2.6 EGCG对米糠蛋白电泳图谱的影响

电泳可以反映EGCG对米糠蛋白亚基结构和共价交联的影响。EGCG对米糠蛋白电泳图谱的影响如图5所示。随着EGCG添加比例的增加，图中各电泳条带颜色深浅无显著变化，条带数目也没有增加或者消失，表明EGCG对米糠蛋白亚基结构没有影响，可能是由于EGCG与米糠蛋相互作用力为非共价作用力。

注：1～7分别代表EGCG与米糠蛋白质量比为0∶1、0.05∶1、0.1∶1、0.15∶1、0.2∶1、0.5∶1、1∶1。图5 EGCG对米糠蛋白电泳图谱的影响

2.7 EGCG对米糠蛋白功能性质的影响

加入不同比例EGCG的米糠蛋白的功能性质如表3所示。随着EGCG添加比例的增大，米糠蛋白的溶解性下降。胡思等[7]研究茶多酚与小麦面筋蛋白相互作用时也发现茶多酚可导致小麦面筋蛋白溶解度下降。EGCG含有酚羟基和没食子酰基，这两种活性基团均可与蛋白质发生较强的相互作用，可能会封闭蛋白质中大量的游离氨基和色氨酸，同时EGCG和蛋白可能复合生成某些不溶性聚合物，从而使得蛋白质溶解度下降[20, 21]。

表3 EGCG对米糠蛋白功能性质的影响

注：同一列中不同肩标小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。

随着EGCG添加比例的增大，米糠蛋白的持水性、持油性先增加后下降，在EGCG和米糠蛋白的质量比为0.15 ∶1时达到最大值。胡湘蜀[22]研究茶多酚与大豆分离蛋白相互作用时也发现随着茶多酚浓度的提高，大豆分离蛋白持水性、持油性同样呈现先增加后下降的变化趋势。随着EGCG添加比例的增加，米糠蛋白持水性先增加后下降的原因可能是EGCG分子的活性羟基以非共价键与蛋白质分子交联，可以使水分子进入蛋白分子内部，从而使蛋白质的持水性得到提高；随着EGCG添加比例继续增大，EGCG与米糠蛋白分子发生较大程度的交联，EGCG与米糠蛋白的结合作用大于水合作用，从而导致蛋白质持水性下降，也可能是EGCG改变了蛋白质分子表面分布的极性基团，导致持水性改变[7, 23]。米糠蛋白持油性先上升后下降的原因：一方面可能是由于EGCG的活性基团和蛋白内部的氨基酸残基接触和反应，使得部分蛋白去折叠，蛋白紧密的组织结构变得疏松，分子间的孔隙率也有所提高，使更多的油能填充到增加的孔隙中；另一方面可能是由于氨基酸残基侧链含量上升，氨基酸提供的疏水基团含量上升导致持油性增加[22, 24]。随着EGCG添加比例继续增大，EGCG与米糠蛋白的交联程度增大，两者之间形成了不可溶性复合物，米糠蛋白与脂质的结合能力迅速降低，使得蛋白质持油性下降[22]。

随着EGCG添加比例的增大，米糠蛋白的起泡能力也呈现出先上升后下降的趋势，在两者质量比为0.2时达到最大值，米糠蛋白的泡沫稳定性呈现出先上升后下降的趋势，在两者质量比为0.15时达到最大值，与郭兴凤等[25]研究不同质量浓度茶多酚对大豆蛋白泡沫性质影响的趋势相同。米糠蛋白起泡能力和起泡稳定性先上升后下降的原因可能是适量的EGCG提供的活性羟基与蛋白质残基通过非共价键结合，蛋白质内部排斥展开，使蛋白质分子柔性增强，蛋白质能较快地在界面上展开，再加上形成的黏膜因为有适量的活性羟基而具有了较好的韧性，从而使得溶液的起泡性能达到较好的效果；随着EGCG添加比例继续增大，过多的活性基团已经占领了界面，在一定程度上阻碍了蛋白质分子在界面上吸附和展开，反而使气泡性能下降[22, 25]。

随着EGCG添加比例的增大，米糠蛋白的乳化性和乳化稳定性变化趋势较为复杂，当EGCG与米糠蛋白的质量比小于0.15∶1时，呈现先上升后下降趋势，随着EGCG添加比例继续增大，乳化性和乳化稳定性再次上升，在EGCG和米糠蛋白的质量比为0.2∶1时达到最大值，随后下降到最小值， 与胡湘蜀[30]研究不同质量浓度茶多酚对大豆分离蛋白乳化性和乳化稳定性影响的趋势相同。EGCG导致米糠蛋白乳化性发生变化的主要原因可能是，适量的EGCG使米糠蛋白交联，提高了米糠蛋白分子油水界面的吸附结合能力，增加了米糠蛋白的乳化功能，过量的EGCG会破坏膜的柔韧性，使蛋白乳化性能变差[22]。另一方面，蛋白质结构的变化也会降低蛋白质的界面吸附速率和重组的能力，例如，蛋白质二级结构中无规则卷曲结构含量的降低和表面疏水性下降，都会使其乳化性下降[26, 27]。因而，米糠蛋白乳化性能的变化是上述因素共同作用的结果。

3 结论

本研究将不同比例的EGCG与米糠蛋白在常温下进行反应，研究EGCG对米糠蛋白结构和功能性质的影响，结果表明：随着EGCG添加比例的增加，米糠蛋白总巯基含量逐渐减少，表明EGCG中的活性羟基可能与米糠蛋白的巯基发生相互作用。随着EGCG添加比例的增加，米糠蛋白的β-折叠结构的含量大幅度增加，而无规卷曲、α-螺旋和β-转角结构所占比例均逐渐减少，氨基酸残基侧链含量增加，表明EGCG对米糠蛋白的二级结构产生了较大影响。米糠蛋白的内源荧光强度下降且发生红移，米糠蛋白的表面疏水性下降，这表明米糠蛋白的芳香族氨基酸残基微环境由疏水性逐渐向亲水性转变。米糠蛋白分子质量分布表明EGCG与米糠蛋白相互作用生成了大分子聚集体。EGCG引发米糠蛋白结构变化的同时，导致其功能性质发生较大变化，随着EGCG添加比例的增加，米糠蛋白溶解性下降，持水性、持油性、起泡能力、泡沫稳定性先增大后下降。米糠蛋白的乳化性和乳化稳定性呈现先上升后下降趋势，后再次上升，最后下降。总的来说，采用适量的EGCG对米糠蛋白进行处理，可以在一定程度上提高其功能性质。