马蹄风味果酒的酿造工艺研究

杨玉霞，廖玲燕，杨紫霞，刘云芬，梁园丽，段振华，宋慕波，帅良，*

（1.贺州学院食品与生物工程学院，食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899；2.北海职业学院，广西北海536000）

马蹄（water chestnut）又称荸荠、尾梨、通天草等，属莎草科多年生浅水草本植物，原产于印度，在我国主要分布于江西、广西、江苏、安徽、浙江、广东等水泽地区，中国马蹄产量占全世界95%以上，其中贺州马蹄占中国产量的50%[1]。马蹄皮薄肉嫩，水分充足，清甜无渣，爽脆可口，富含碳水化合物、多糖、各种维生素、胡萝卜素、脂肪、蛋白质、荸荠英、多酚类等营养物质[2]。马蹄可蔬可果，可粮可药自古就有“地下雪梨”和“江南人参”的美誉，是加工功能保健食品的最佳原料之一[3]，马蹄产品有马蹄粉、马蹄糕、马蹄罐头、马蹄饮料、马蹄果醋[4]等，在产品生产过程中产生了大量废弃物马蹄皮，马蹄皮含有丰富黄酮类、多酚、甾醇类、色素[5]，也是回收再利用的重要材料；目前对马蹄果酒研究很少，潘百明等[6]利用马蹄皮发酵而成的果酒，酒精度达11%左右；韩明等[7]研制的马蹄汁酒精饮品，酒精度较低。因此利用马蹄全果发酵果酒既能提高果酒营养价值，同时也解决马蹄果皮资源浪费的问题。

本文以马蹄全果为原料，运用酶解-发酵技术，采用正交试验优化酶解、发酵过程的工艺参数，旨在研制一款具有马蹄风味、口感怡人的特色果酒，为马蹄产品开发及资源综合利用提供理论参考。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

马蹄：贺州泰兴超市，挑选无病虫害和无机械损伤的马蹄；白砂糖：市售；乳酸（食品级）：河南金丹乳酸科技股份有限公司乳酸；淀粉酶（3 000 U/g）、纤维素酶（30 000 U/g）：湖南新鸿鹰生物有限公司；果酒酒曲：永州市雅大科技实业有限公司。

1.2 仪器设备

数显恒温水浴锅（HH-6）：国华电器有限公司；低速离心机（KDC-40）：安徽科大创新股份有限公司；原汁机（JYZ-E92）：九阳股份有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1901PC）：上海奥析科学仪器有限公司；恒温培养箱（pH-070A）：上海一恒科学仪器有限公司；实验室pH计（FE20）：梅特勒-托利多；数显折光仪（LHB55）：杭州陆恒生物科技有限公司；旋转蒸发仪（RE311）：日本雅马拓仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 工艺流程

2.1.1 马蹄酶解液的制备流程

2.1.2 马蹄果酒发酵工艺流程

2.2 操作要点

材料预处理：马蹄洗净切块，放入清水中浸泡防止氧化，蒸汽预煮15 min软化马蹄，打浆备用。

酶解：马蹄果浆装入洁净容器中，按比例加水调整浓度，用乳酸调整pH值，加入淀粉酶、纤维素酶，在适宜的温度、pH值、时间下酶解。

成分调整：在酶解结束的马蹄浆中，加入白砂糖、乳酸，将其调成合适的糖度、pH值，冷却。

发酵：将酶解好的马蹄浆倒入发酵瓶中，加入2/3为宜，添加果酒酒曲，密封发酵，发酵第1天间歇搅拌，当发酵液面泡沫消失即发酵终点。

过滤、澄清：将发酵结束的酒醪用虹吸法过滤，静置澄清2 d。

杀菌：将澄清的酒液于60℃～65℃的恒温水浴锅加热20 min～25 min，取出迅速冷却至26℃～28℃。

2.3 单因素和正交试验设计

酶解条件优化：以马蹄浆为原料接入淀粉酶和纤维素酶进行酶解，以透光度、总糖含量作为酶解指标，分别对淀粉酶用量（质量比）、纤维素酶用量（质量比）、料液比、酶解温度和时间进行单因素试验，再根据各单因素试验结果，设置L（934）酶解正交试验，研究各因素对马蹄浆酶解过程的影响。正交因素水平见表1。

表1 酶解正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for enzymatic hydrolysis

酒精发酵条件优化：以酶解后获得的酶解液作为发酵原料，分别以果酒酒曲用量（质量比）、初始糖度、发酵前pH值、温度为因素考察其对马蹄果酒发酵过程的影响，并设计L9（34）正交试验，正交因素水平见表2。

2.4 分析方法

2.4.1 透光度的测定

取酶解样液50 mL在4 000 r/min离心10 min，取上清液，用分光光度计在波长680 nm下测定透光度[8]。

2.4.2 总糖的测定

采用费林试剂法测定[9]。取5 mL样品水解液于100 mL的锥形瓶，并加入甲、乙液各5 mL，摇匀，加热至沸腾状态，用葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，即为滴定终点。依据葡萄糖标准溶液所消耗体积，由公式可计算总糖含量。

式中：X为样品总糖的含量，g/L；V0为空白试验消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；V为样品消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；c为葡萄糖标准溶液的浓度，g/mL；n为样品稀释倍数。

2.4.3 酒精度的测定

采用酒精计法[10]，用100mL容量瓶准确量取100mL酒液于500 mL的蒸馏瓶中，再用100 mL蒸馏水分3次冲洗容量瓶，全部倒入蒸馏瓶中。缓慢蒸馏至接近100 mL，取下，放在20℃水浴保温30 min，将馏出液倒入100 mL量筒中，放入洁净的酒精计，待其平衡后，水平读取与月牙面相切处的刻度值，即为酒精度，单位为%。

2.4.4 糖度的测定

用数显折光仪测定。

2.4.5 pH值测定

用pH计测定。

2.4.6 感官评价测定

请10位老师同学按香气、滋味、颜色、风格4个方面对马蹄果酒进行感官评价（满分为100分）[11-12]，感官评分标准见表3。

表3 马蹄果酒感官评分标准Table 3 Sensory evaluation standard of water chestnut fruit wine

3 结果分析

3.1 酶解工艺的确定

3.1.1 淀粉酶的确定

以料液比为1∶3（g/mL）制成马蹄浆，纤维素酶添加量0.02%，酶解温度70℃，pH值为6.0，酶解时间60 min，淀粉酶添加量分别以0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%进行酶解，比较不同淀粉酶添加量对透光度和总糖含量的影响，结果见图1。

图1 淀粉酶用量对马蹄酶解的影响Fig.1 Effects of amylase addition on water chestnut enzymatic hydrolysis

由图1可知，添加淀粉酶能明显提高马蹄浆的透光度和总糖含量，随着淀粉酶添加量的增加，透光度和总糖含量也逐渐变大，当淀粉酶添加量达0.3%，透光度为77.89%，总糖含量达23.01 g/L；之后继续增加淀粉酶用量，透光度值没有明显变化，总糖含量也趋于平稳甚至出现降低的现象。由于底物被消耗完，酶解反应达到终点，酶分子的竞争导致此现象发生。这说明适量的淀粉酶有助于提高马蹄浆的透光度和总糖含量；淀粉酶过量时，效果不会出现较大的提升，甚至会有反作用。由此可知，在马蹄浆酶解过程中淀粉酶的添加量0.3%为宜。

3.1.2 纤维素酶的确定

以料液比为1∶3（g/mL）制成马蹄浆，淀粉酶添加量0.2%，温度70℃，pH 6.0，分别加入0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%纤维素酶，酶解时间60 min，比较不同纤维素酶添加量对透光度和总糖含量的影响，结果见图2。

马蹄皮中含有丰富的纤维素，纤维素酶能将纤维素降解为葡萄糖。由图2可知，纤维素的用量对马蹄浆的品质影响较大，当纤维素酶的添加量在0%～0.02%之间时，马蹄浆酶解液的透光度和总糖含量不断增加，透光度从59.43%上升至82.04%，总糖含量从19.23 g/L上升至23.16 g/L；然而当添加量超过0.02%之后，透光度变化不明显，总糖含量趋于平稳甚至降低。考虑到效果与成本问题，纤维素酶的最佳用量选择0.02%。

图2 纤维素酶用量对马蹄酶解的影响Fig.2 Effects of cellulose addition on water chestnut enzymatic hydrolysis

3.1.3 酶解温度的确定

以料液比1∶3（g/mL）制成马蹄浆，纤维素酶添加量为0.02%，淀粉酶添加量为0.2%，pH 6.0，温度分别为 60、65、70、75、80℃的条件下酶解 60 min，比较不同温度对马蹄浆酶解液透光度和总糖含量的影响，结果见图3。

图3 温度对马蹄浆酶解的影响Fig.3 Effects of temperature on Water chestnut enzymatic hydrolysis

温度对酶活性有很大影响，从而影响酶促反应。由图3可知，温度从60℃到70℃时，透光度呈逐渐增大的趋势，其中温度为70℃时，透光度达最大值68.09%，而超过70℃以后，透光度快速下降直至不变。然而，温度为超过70℃之后，总糖含量是呈下降趋势。这说明合适的温度范围内，酶解随着温度升高，酶活性增强，但超过适宜温度，不宜酶与底物反应，甚至使酶失活[13]。因此，初步确定酶解温度为65℃。

3.1.4 酶解时间的确定

以料液比为1∶3（g/mL），纤维素酶添加量0.02%，淀粉酶添加量0.2%，酶解温度70℃，pH6.0为条件，酶解时间分别为 30、60、90、120、150 min 进行试验，比较不同酶解时间对透光度和总糖含量的影响，结果见图4。

图4 时间对马蹄酶解的影响Fig.4 Effects of time on water chestnut enzymatic hydrolysis

酶解时间的长短，决定着酶解的充分程度，是酶解的关键因素之一。由图4可知，反应时间在30 min～90 min时，总糖含量不断增加，超过90 min以后，总糖量逐渐减小；然而当酶解时间大于60 min以后，透光率开始不断下降。这说明了酶解时间与反应密切相关，时间过短，酶解反应不充分；时间过长，对酶解液的澄清度有较大影响[14]。所以，综合考虑，初步确定酶解时间为60 min。

3.1.5 酶解pH值的确定

料液比为1∶3（g/mL）制成马蹄浆，纤维素酶添加量0.02%，淀粉酶添加量0.2%，温度70℃，pH值分别调整为 5.5、6.0、6.5、7.0，酶解 60 min，比较不同 pH 值对透光度和总糖含量的影响，结果见图5。

图5 pH值对马蹄酶解的影响Fig.5 Effects of pH on water chestnut enzymatic hydrolysis

由图5可知，当pH 6.0时，透光度和总糖含量均达最高，分别为 78.42%，22.64 g/L；当 pH＞6.0之后，透光度大小和总糖含量都开始出现下降，原因是不同pH值环境影响酶的活性。因此，酶解pH值定为6.0，而且不用于正交试验的考虑因素。

3.1.6 料液比的确定

料液比分别为 1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5（g/mL），在淀粉酶添加量0.2%，纤维素酶添加量为0.02%，温度为70℃，pH6.0的条件下酶解60 min，比较不同料液比对透光度和总糖含量的影响，结果见图6。

图6 料液比对马蹄浆酶解的影响Fig.6 Effects of solid-liquid ratio on water chestnut enzymatic hydrolysis

不同料液比对酶解底物的溶度有很大影响，底物浓度与酶解关系密切，浓度过大或过小都会影响酶分子与底物的接触面积，从而影响酶解反应是否充分[15]。由图 6 可知，在料液比 1 ∶1（g/mL）到 1 ∶3（g/mL）之间，透光度不断升高；料液比1∶3（g/mL）之后，开始降低；当料液比为1∶3（g/mL）时，酶解效果最好，考虑到浓度过稠或过稀可能会影响发酵的品质，因此，最佳酶解的料液比选择1∶3（g/mL），且不作为正交试验的参考因素。

3.1.7 酶解正交试验结果与分析

根据各单因素试验结果，综合考虑选择淀粉酶的用量、纤维素酶的用量、温度、时间进行正交试验，酶解正交试验结果见表4。

表4 L9（34）酶解正交试验结果与分析Table 4The result and analysis of L9（34）orthogonal experiment for enzymatic hydrolysis

续表4 L9（34）酶解正交试验结果与分析Continue table 4The result and analysis of L9（34）orthogonal experiment for enzymatic hydrolysis

由表4中的方差分析可以知道，各因素对酶解的影响程度为：D＞A＞C＞B，即时间＞淀粉酶用量＞温度＞纤维素用量，最佳酶解条件为D1A3C1B1，酶解时间30 min，淀粉酶添加量为0.4%，酶解温度为60℃，纤维素用量0.015%。

3.1.8 验证试验

采用正交试验中透光度最高的组合D1A3B3C2与正交试验极差分析中得到的最优组合D1A3B1C1进行验证试验。经D1A3B1C1处理的马蹄浆总糖含量27.04 g/L，透光度89.16%，上清液澄清透亮，马蹄香气怡人。经D1A3B3C2处理的总糖含量较低，25.30g/L，透光度85.2%，马蹄香不足。因此，酶解工艺最优组合为D1A3B1C1，即酶解时间30 min，淀粉酶接入量0.4%，酶解温度60℃，纤维素用量0.015%。

3.2 发酵工艺参数的确定

3.2.1 果酒酒曲用量的确定

经酶解处理的马蹄浆用白砂糖将初始糖度调为22%，发酵初pH值为5.5，分别加入果酒酒曲0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%于28℃恒温箱内发酵，7 d后，酒液面泡沫基本消失，即为发酵终点，结果见表5。

表5 果酒酒曲用量对果酒的影响Table 5 Effects of Wine could on fruit wine

随着果酒酒曲的增加，酒精度逐渐上升；酒曲加入量过大时，发酵剧烈，虽然产酒精能力强，但糖分消耗快，有轻微的异味，口感不协调；酒曲加入量过小时，发酵速度缓慢，酒精度低，醇香不足，口感平淡，澄清度不够[16-17]。所以，酒曲用量为0.5%比较合适。

3.2.2 发酵初始糖度的确定

经酶解处理的马蹄浆用白砂糖将初始糖度分别调为18%、20%、22%、24%、26%，酒曲添加量为0.5%，发酵初始pH 5.5，在28℃恒温箱中发酵7 d，结果见表6。

表6 发酵初始糖度对果酒的影响Table 6 Effects of sugar content on fruit wine

发酵时，酒曲利用糖分进行生长繁殖，并产出酒精、酯类等物质，当糖度合适时酵母繁殖和代谢速度都比较快[18]，但当糖度过高时，样品渗透压加大，会抑制酵母菌的生长繁殖，导致酒精度下降[19-20]，同时，高糖度也会促进高级醇、琥珀酸等副产物的生成，导致果酒口味苦涩刺喉，感官品质下降[21]；当糖度过低时，发酵不充分，酒精度低，甜度不足，口感不协调。综上所述，初始糖度22%最佳。

3.2.3 发酵温度的确定

经酶解处理的马蹄浆用白砂糖将初始糖度调为22%，发酵初始pH5.5，加入果酒酒曲0.5%，分别在24、26、28、30、32 ℃的条件下发酵 7 d，结果见表 7。

表7 发酵温度对果酒的影响Table 7 Effects of fermenting temperature on fruit wine

随着温度的升高，酒精度也逐渐升高，原因是低温时酒曲的生长受到抑制，使得糖的转化率小，发酵不彻底，酒精度偏低风味平淡[7]，温度过高时，虽然酒精度高，但是感官评价低，由于过高的温度不利于酒液中的香气保存，不易控制杂菌的生长繁殖，使得酒体澄清度不够，有异味。所以最佳发酵温度是28℃。

3.2.4 发酵前pH值的确定

经酶解处理的马蹄浆用白砂糖将初始糖度调为22%，加入果酒酒曲0.5%，分别在调整pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在 28 ℃下发酵 7 d，结果见表 8。

表8 发酵pH值对果酒的影响Table 8 Effects of pH on fruit wine

由表8可知，当pH 6.0时，酒精度和感官评价都是最高。pH值较低时，酒精度偏低，酒体不够澄清，香气不足。所以，最佳pH值为6.0。

3.2.5 发酵正交试验结果分析

发酵正交试验结果见表9。

表9 L9（34）发酵正交试验结果与分析Table 9The result and analysis of L9（34）orthogonal experiment for fermentation

由表9方差分析可知，影响马蹄果酒品质的主次因素是C＞A＞B＞D，即时间＞淀粉酶用量＞温度＞纤维素用量；最佳发酵组合是C2A3B3D2，即发酵温度30℃，果酒酒曲用量0.5%，初始糖度24%，pH6.0。在此条件下进行验证试验，马蹄果酒感官评价为92分，比正交试验感官评价最高组合C2A3B3D1评分高。酒精度为12%，酒液颜色淡黄，澄清透亮，酒香与马蹄香协调，口感纯正。

4 结论

本研究确定了马蹄酶解工艺条件，在单因素条件基础上进行正交试验，结果显示各因素对酶解的影响程度为：时间＞淀粉酶用量＞温度＞纤维素用量，马蹄酶解的最优条件为酶解时间30 min，淀粉酶添加量为0.4%，酶解温度为60℃，纤维素用量0.015%。在最优的酶解条件下进行酒精发酵工艺研究，结果表明，马蹄果酒发酵最优条件是发酵温度30℃，果酒酒曲用量0.5%，初始糖度24%，pH值为6.0。在此条件下发酵的马蹄果酒，颜色为浅黄色，清澈透亮且有光泽，酒香浓郁伴有马蹄清香，酸甜适中，口感纯正。本研究有一定的实用价值，可为特色营养马蹄风味果酒的进一步研究提供参考依据。