适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉的致敏性评价

石佳琪，李想，贾晓江，朱宏，王世杰，3，王硕，*

（1.南开大学医学院，天津市食品科学与健康重点实验室，天津300350；2.石家庄君乐宝乳业有限公司河北省乳制品研发与安全控制重点实验室，河北石家庄050221；3.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）

牛奶是生命早期摄入的最基本且重要的营养物质之一，富含满足新生儿生长发育所需的多种营养成分，逐渐成为母乳的替代品。但是，由于肠道屏障和免疫系统尚未发育完全，婴儿易对牛奶中一种或多种蛋白质产生牛奶过敏反应（cow's milk allergy，CMA）[1]。

CMA是儿童早期最常见的食物过敏之一，发病率在2%到3%之间[2]，此类过敏反应的主要症状有轻微皮肤瘙痒、荨麻疹、鼻结膜炎、哮喘、呕吐、腹泻，甚至全身过敏性休克和死亡[3]。CMA最常出现在婴儿期和幼儿期，通常是出生后前12个月，并有随着年龄增长而减弱或消失的趋势[4]。尽管人们日益认识到牛奶过敏是一个严重的健康问题，但由于缺乏有效的治疗方法，对食物过敏的治疗主要依赖于避免过敏原接触，以防止过敏个体因食物引起的不良反应[5]，但这可能会带来与生长不足，神经系统发育和心血管健康相关的潜在营养不良影响[6]。

牛奶中含有20多种引起过敏反应的蛋白质，其中乳清蛋白和酪蛋白为主要过敏原[7]。目前，通过酶解法破坏牛奶蛋白抗原表位是减弱其致敏性的有效方式之一[8]。因此，建议高危婴儿或被诊断出对牛奶过敏的婴儿选择由牛奶水解物制成的低过敏原配方奶粉[9]。尽管母乳几乎是所有婴儿的最佳营养来源，但相比于纯母乳喂养，适度水解乳清蛋白配方奶粉和深度水解乳清蛋白或酪蛋白配方奶粉均可防止过敏性疾病高发婴儿过敏[10]。此外，在婴儿出生后的前4个月，将水解配方奶粉而非传统配方奶粉作为母乳补充或替代品，可降低婴儿出生后第一年患过敏的风险[11]。因此，当易过敏儿童无法进行母乳喂养时，水解牛乳蛋白奶粉是预防牛奶过敏临床症状发展的最佳选择[12]。

本文以乳清蛋白浓缩物为阳性对照，采用BALB/c小鼠建立过敏模型，通过观察过敏症状，计算脾脏系数，测定血清中总免疫球蛋白E（IgE）及组胺含量，对前期研制的适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉进行致敏性评价，并与普通脱脂奶粉和深度水解乳清蛋白粉作比较，旨为后续低致敏奶粉的开发提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

4周龄SPF级雌性BALB/c小鼠：维通利华实验动物中心。南开大学SPF级实验动物中心提供足量无牛奶蛋白维持鼠粮及清洁饮用水，相对湿度50%～55%，平均温度（23±2）℃，光照周期为12 h。

适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉（partially hydrolyzed whey formula，pHWF）：实验室研发，含低聚半乳糖8.5 mg/g、低聚果糖4 mg/g及多聚果糖5 mg/g；深度水解乳清蛋白粉（whey protein hydrolysate，WPH）、80%乳清蛋白浓缩物（80%whey protein，WPC80）及普通脱脂奶粉（skimmed milk powder，SMP）：市售。

霍乱毒素（CT）：Sigma-Aldrich；小鼠血清IgE检测试剂盒、小鼠血清组胺检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 主要仪器

高速冷冻离心机（ST16R）：赛默飞世尔科技有限公司；酶标仪（InfiniteR200 PRO NanoQuant）：瑞士帝肯；电子天平（QUINTIX124-1CN）：德国赛多利斯；旋涡混合器（VORTEX-5）：其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计

将60只BALB/c小鼠分成6组（n=10），分别为空白组、CT组、80%乳清蛋白浓缩物（WPC80）组、适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉（pHWF）组、深度水解乳清蛋白粉（WPH）组及普通脱脂奶粉组（SMP）。其中WPC80组为阳性对照组，空白组不做任何处理，CT组仅灌胃霍乱弧菌毒素（CT）10 μg/只。致敏周期为6周，每周1次。实验组前5次灌胃致敏剂量为20 mg/只，并辅以霍乱弧菌毒素（CT）10 μg/只，以防小鼠产生免疫耐受，最后一次灌胃致敏剂量为50 mg/只。各组以超纯水为溶剂，灌胃体积为0.3 mL。最后一次灌胃前称量各组小鼠体重，并在灌胃后1 h，对各组小鼠进行过敏症状评分。处死小鼠，收集血液储存于-80℃冰箱，摘取脾脏并称量重量，计算脾脏系数，公式[13]如下：

脾脏系数/%=脾重/体重×100

1.3.2 血清总IgE及组胺含量的测定

血液在室温25℃中静置2 h后置于低温冷冻离心机中以4 000 r/min，离心15 min，小心吸取上清液，储存于-80℃冰箱。若在保存过程中出现沉淀，需在使用前再次离心。使用商业化酶联免疫试剂盒测定血清中总IgE和组胺的含量。

1.3.3 过敏症状评分

过敏症状出现在灌胃后15 min～30 min，并在第一症状出现后40 min～50 min达到峰值。采用Li等[14]的评分标准系统评价小鼠过敏症状：0=无症状；1=在鼻子和头部周围划伤和摩擦；2=眼睛和嘴周围浮肿，毛发竖起，活动减少和/或活动减少伴随呼吸急促；3=喘息、呼吸急促和嘴和尾巴周围的发绀；4=在刺激、震颤和抽搐后没有活动；5=死亡。

1.3.4 统计学分析

所有数据结果均使用GraphPad Prism 5软件作图，并在SPSS软件进行差异显著性分析。采用单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异显著性，P＜0.05表示具有差异显著性，P＜0.01表示具有极显著性差异，P＞0.05则无显著差异性。

2 结果与分析

2.1 小鼠过敏症状评分

不同样品对小鼠过敏症状的影响见图1。

如图1所示，WPC80组的过敏症状评分最高，SMP组过敏症状评分较低，空白组、CT组、pHWF组和WPH组的过敏症状评分均为0，说明乳清蛋白浓缩物致敏作用最强，导致该组小鼠过敏情况较严重，普通脱脂奶粉组小鼠轻微过敏，而适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉组和深度水解乳清蛋白粉组并无过敏症状。

2.2 小鼠的体重变化

不同样品对小鼠体重的影响见图2。

图1 过敏症状评分Fig.1 Anaphylactic symptom scores

图2 小鼠的体重变化Fig.2 Body weight changes of mice

分别在每次灌胃前称量小鼠体重，计算平均数。如图2所示，空白组、CT组及pHWF组小鼠体重随时间稳定上升，而WPC80组小鼠体重在第4次灌胃后出现下降趋势，SMP组小鼠体重在第5次灌胃后也开始下降，这可能是由于乳清蛋白导致小鼠过敏使其体重减轻。段翠翠等[15]在进行不同乳源蛋白致敏性研究时，也出现了由于β乳球蛋白导致小鼠致敏而体重下降的现象，与本文结果一致。WPH组小鼠体重在第4次灌胃后也出现下降，可能是蛋白被深度水解导致营养不良而影响其体重增加。各组间体重无显著差异性。

2.3 小鼠的脾脏系数

不同样品对小鼠脾脏系数的影响见图3。

图3 小鼠脾脏系数Fig.3 The spleen index of mice

脾脏是机体最大的免疫器官，也是机体产生抗原特异性T细胞反应和B细胞产生抗体的重要组织之一。脾脏系数能在一定程度上反应机体免疫功能[16]。如图3所示，WPC80组和SMP组脾脏系数显著增加（P＜0.05），pHWF组和WPH组脾脏系数显著降低（P＜0.05），与空白组无显著差异（P＞0.05），这说明乳清蛋白可通过损伤免疫器官来破坏宿主全身免疫功能，而乳清蛋白被不同程度水解后可显著减轻此损伤。霍乱毒素是一种食物过敏研究中常用的免疫佐剂，可增强机体免疫应答反应以防止产生免疫耐受，这可能是CT组脾脏系数显著增加的原因之一。

2.4 小鼠血清中总IgE含量

不同样品对小鼠血清中总IgE含量的影响见图4。

图4 小鼠血清中总IgE含量Fig.4 Total IgE content in serum of mice

血清总IgE水平是过敏反应的标志物之一，与儿童过敏症状明显相关[17]。如图4所示，WPC80组血清中总IgE水平显著高于空白组、CT组、pHWF组及WPH组（P＜0.01），但与SMP组之间的差异不显著（P＞0.05）。SMP组血清中总IgE水平显著高于空白组、CT组、pHWF组（P＜0.05），但与WPH组之间的差异不显著（P＞0.05）。空白组、CT组、pHWF组及WPH 组之间血清中总IgE水平的无显著差异（P＞0.05）。这些结果表明：乳清蛋白作为牛奶蛋白中的重要过敏原，可显著提高过敏小鼠血清中总IgE的含量，进而强烈刺激IgE介导的速发型过敏反应的发生，而乳清蛋白被适度水解后可显著减弱其对IgE介导的速发型过敏反应的刺激。

2.5 小鼠血清中组胺含量

不同样品对小鼠血清中组胺含量的影响见图5。

图5 小鼠血清中组胺含量Fig.5 Histamine content in serum of mice

在过敏反应期间，肥大细胞脱颗粒后释放的组胺是I型过敏反应急性期中特征最明确，最有效的血管活性介质[18]。如图5所示，WPC80组血清中组胺水平显著高于pHWF组（P＜0.01）、空白组、CT组及WPH组（P＜0.05），但与SMP组之间的差异不显著（P＞0.05）。SMP组血清中组胺水平显著高于pHWF组（P＜0.05），但与空白组、CT组及WPH组之间的差异不显著（P＞0.05）。空白组、CT组、pHWF组及WPH组之间血清中组胺水平不存在差异显著性（P＞0.05）。以上结果说明乳清蛋白浓缩物对小鼠肥大细胞的刺激作用最强，普通脱脂奶粉的刺激作用次之，而深度水解乳清蛋白粉和适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉的刺激作用较弱。

综上，乳清蛋白浓缩物组小鼠过敏情况最严重，其次是普通脱脂奶粉组。深度水解乳清蛋白粉组和适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉组小鼠均无过敏症状。相较于普通脱脂奶粉，适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉破坏部分乳清蛋白抗原表位，有效减弱乳清蛋白的致敏性。深度水解乳清蛋白粉组血清中总IgE和组胺含量略高于适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉组，但无显著性差异，可能是适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉添加了低聚果糖和低聚半乳糖等益生元可减弱过敏反应，降低血清中总IgE含量和组胺水平[19-20]。因此，适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉降低了牛奶过敏反应发生的风险。

3 结论

本研究成功建立以乳清蛋白为致敏原的过敏模型，该组小鼠表现出严重的过敏症状，伴随脾脏受损，血清中总IgE含量升高，肥大细胞脱颗粒释放组胺增多，激发速发型过敏反应。适度水解乳清蛋白婴儿可有效减弱乳清蛋白致敏性，抑制IgE介导的速发型过敏反应的发生。因此，建议不能完全进行母乳喂养或患有过敏性疾病遗传风险的婴儿选择适度水解乳清蛋白婴儿配方奶粉，以避免发生牛奶过敏反应。