铁皮石斛水溶性总蛋白对大鼠胃黏膜损伤及炎症反应的保护机制研究

张婉迎，白雪媛，杨俊杰，韩冰，张巍，王思明

（长春中医药大学，吉林长春130117）

铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的干燥茎，为我国传统名贵药材，享有“中华九大仙草”之首的美誉，目前作为一种常见的保健品被人们广泛接受[1]。古籍中多有其“厚肠胃”“平胃气”“清胃热”“健脾开胃”等论述[2-3]，且诸多学者认为铁皮石斛多糖（polysaccharides from Dendrobium officinale，DOP）对胃黏膜具有保护作用[4-5]，但铁皮石斛水溶性总蛋白保护胃黏膜损伤的作用却未见报道。

阿司匹林作为非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）的代表，近年来广泛应用于治疗各种风湿性疾病及心脑血管疾病的预防，是全球最畅销的药品之一。其所致的胃黏膜损伤、溃疡及出血等急性胃黏膜病变（acute gastric mucosal lesion，AGmL）目前已引起人们的重视，其主要病理特征为急性应激性病变，使机体产生氧化应激及炎症反应，是临床上常见的急性胃黏膜病变之一[6]。目前已报道临床上可用于保护胃黏膜的药物有质子泵抑制剂、铝／铋制剂、H2受体拮抗剂、胃泌素受体等，但往往存在疗效不持久、停药后容易复发、副作用多、价格昂贵等诸多缺点，这些缺点使得NSAIDs的临床应用受到了极大限制[7-11]。因此，积极研究并开发纯天然的中药成分抑制阿司匹林所致的胃黏膜损伤对NSAIDs的临床应用有极大意义。

本文在课题组前期研究基础上，采用铁皮石斛水溶性总蛋白对阿司匹林诱导的大鼠急性胃黏膜损伤进行预保护，通过测定大鼠血清中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，胃组织中环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 的表达量以COX-2、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk1/2）蛋白的表达量，证实铁皮石斛水溶性总蛋白保护大鼠急性胃黏膜损伤及炎症反应的机制可能与增强PGE2等胃黏膜保护因子，清除氧自由基，降低炎症反应介质并激活Erk1/2通路使胃黏膜细胞增殖有关，为日后进一步开发铁皮石斛产品提供数据支撑。

1 材料

1.1 药品及试剂

铁皮石斛：婷美小屋；铁皮石斛水溶性总蛋白：长春中医药大学中医药大健康创新中心提供；阿司匹林（纯度＞99.0%）：Sigma公司；奥美拉唑（纯度＞98%）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）：索莱宝公司；大鼠血清 PGE2、IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD、MDA酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒：上海朗顿生物技术有限公司；RIPA裂解液：碧云天生物技术公司；Trizol：Thermo Fisher Scientific；反转录试剂盒、宝生物染料法荧光定量试剂盒（SYBR）：日本TaKaRa公司；β-Actin抗体、COX-2 抗体：美国 Bioworld 公司；Erk1/2、pErk1/2抗体：美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 主要仪器

全自动酶标仪（Infinite M200PR0）：瑞士帝肯公司；Mini Protean蛋白电泳仪（PowerPacTMHC）、实时荧光定量PCR仪（CFX connect）：美国伯乐公司；智能成像系统（iBright FL1000）：美国赛默飞世尔公司。

1.3 动物

SPF级Wistar大鼠：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

2 方法

2.1 大鼠分组、给药以及急性胃损伤模型的建立

选取 6周龄 Wistar大鼠（200 g～250 g）50只，雌雄各半，随机分为空白对照组、模型组，铁皮石斛水溶性总蛋白低剂量组、高剂量组，阳性对照组。适应性饲养7 d后，空白对照组与模型组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠；低剂量组、高剂量组分别给予10、20 mg/kg，阳性对照组给予奥美拉唑3 mg/kg，连续5 d。末次给药后禁食不禁水，除空白对照组外均采用300 mg/kg阿司匹林灌胃5 h建立胃黏膜损伤模型。

2.2 胃黏膜损伤评价

大鼠腹腔注射适量10%水合氯醛，麻醉后固定在解剖板上，沿腹中线由下而上剪开腹腔，摘除胃，用生理盐水清洗，沿胃大弯剪开，用冰生理盐水轻轻冲洗胃黏膜表面的污物，用滤纸吸干、除净胃黏膜表面的黏液、血凝块等，用4%多聚甲醛固定，拍照后用Image J软件分析胃黏膜损伤程度[12]。

2.3 ELISA 检测血清中 PGE2、IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、MDA的含量

大鼠腹腔注射适量10%水合氯醛，麻醉后固定在解剖板上，沿腹中线由下而上剪开腹腔，腹主动脉采血5 mL，4℃条件下3 000 r/min离心10 min，取上层血清。按照ELISA KIT说明书中操作方法测定血清中PGE2、IL-1β、IL-6、TNF-α 含量[13]。

2.4 RNA提取及逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）

取适量胃组织，放入用放入用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理并经过高温高压灭菌过的水浸泡过夜的预冷研钵中，加入液氮小心研磨至无肉眼可见组织块，加入1 mL Trizol提取RNA，测定浓度后，根据反转录试剂盒说明书操作，将其反转录为cDNA。将cDNA稀释适当倍数后，取2.5 μL，加入到含 SYBR Premix Ex Taq TMⅡ（2×）12.5 μL、双蒸水8 μL、上下游引物各1μL的体系中。反应条件：95℃预变性 30 s、95 ℃变性 5 s、退火 30 s、72 ℃延伸 20 s，40个循环[14]。反应后绘制扩增曲线，对目的基因扩增后产物的表达量与β-Actin扩增后表达量的比值进行结果分析。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

续表1 引物序列Continue table 1 Primer sequences

2.5 蛋白提取和Western blot

适量胃组织，放入预冷研钵中，加入液氮小心研磨至无肉眼可见组织块，加入1 mL RIPA裂解液裂解液及10 μL PMSF，用移液器吹打数次后转移至离心管中，冰上裂解20 min，4℃条件下12 000 r/min离心10 min，取上清，使用BCA试剂盒测定蛋白含量，制样。配置聚丙烯酰氨凝胶电泳所需的凝胶，上样，70 V 30 min，140 V 50 min电泳后使用NC膜18 V 350 mA半湿法转膜20 min，5%磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）配置的 奶粉封闭30 min，磷酸盐吐温缓冲液（phosphate tween buffer，PBST）洗涤膜片3 次，每次5 min，切膜，4℃一抗孵育过夜（β-Actin、Erk1/2、pErk1/2均按1∶1 000稀释；COX-2按 1∶500稀释），收集一抗，用1%PBS奶粉稀释二抗，二抗孵育1 h，显色处理，避光。结果用Image J软件进行灰度值分析。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 胃损伤程度

大鼠胃黏膜损伤情况见图1。以胃黏膜损伤面积占整个胃黏膜面积的百分比来评价胃的损伤程度，结果见表2。

图1 大鼠胃黏膜损伤情况Fig.1 Rat gastric mucosal injury

表2 各组大鼠给药剂量及胃损伤程度（±s，n=10）Table 2 The dose of rats and the degree of gastric damage in each group（±s，n=10）

表2 各组大鼠给药剂量及胃损伤程度（±s，n=10）Table 2 The dose of rats and the degree of gastric damage in each group（±s，n=10）

注：与对照组相比##p<0.01表示差异极显著；与模型组相比**p<0.01表示差异极显著；-表示未给药。

处理剂量/（mg/kg）胃损伤程度/%空白对照组 - 3.04±0.692模型组 - 56.34±2.71##铁皮石斛水溶性总蛋白 10 38.88±0.59**20 15.87±0.84**奥美拉唑 3 26.39±1.02**

空白对照组胃损伤面积为（3.04±0.692）%，结果与模型组相比有极显著差异（p<0.01）。模型组、低剂量组、高剂量组及奥美拉唑组经阿司匹林灌胃5 h损伤后的损伤面积分别为（56.34±2.71）%、（8.88±0.59）%、（15.87±0.84）%以及（26.39±1.02）%。各给药组与模型组相比均有极显著性差异，且铁皮石斛水溶性总蛋白高剂量组恢复效果最好。表明随着铁皮石斛水溶性总白浓度的增大胃损伤程度逐渐下降，铁皮石斛对胃损伤具有一定的预防作用。

3.2 铁皮石斛水溶性总蛋白对大鼠血清中PGE2水平的影响

大鼠血清中PGE2水平如表3所示。

表3 大鼠血清中PGE2水平（±s，n=10）Table 3 PGE2 levels in rat serum（±s，n=10）

表3 大鼠血清中PGE2水平（±s，n=10）Table 3 PGE2 levels in rat serum（±s，n=10）

注：与对照组相比##p<0.01表示差异极显著；与模型组相比**p<0.01表示差异极显著。

组别PGE2/（ng/L）空白对照组 654.4±30.18模型组 331.46±10.74##低剂量组 424.8±49.8高剂量组 569.64±44.77**奥美拉唑组 480.02±21.89**

与对照组相比，模型组大鼠血清中PGE2水平明显下降（p<0.01），铁皮石斛水溶性总蛋白预保护使大鼠血清中PGE2水平逐渐回升，且高剂量组效果最好（p<0.01），表明铁皮石斛水溶性总蛋白可以通过升高PGE2含量达到保护阿司匹林诱导的胃黏膜损伤的效果。

3.3 铁皮石斛水溶性总蛋白对大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影响

大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平如表4所示。

表4 大鼠血清中炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（±s，n=10）Table 4 Levels of inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α in rat serum（±s，n=10）

表4 大鼠血清中炎症因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（±s，n=10）Table 4 Levels of inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α in rat serum（±s，n=10）

注：与对照组相比##p<0.01表示差异极显著，#p<0.05表示差异显著；与模型组相比*p<0.05表示差异显著，**p<0.01表示差异极显著。

组别IL-6/（ng/L）IL-1β/（ng/L）TNF-α/（ng/L）空白对照组 177.08±0.6 29.13±3.68 156.47±7.32模型组 343.98±12.14##57.35±4.01##341.49±36.07#铁皮石斛水溶性总蛋白低剂量组229.90±30.86**43.07±2.01*209.12±4.51**铁皮石斛水溶性总蛋白高剂量组128.45±8.17**34.10±3.07**169.39±14.24*奥美拉唑组 172.67±2.90**39.45±3.97*207.19±16.39

与对照组相比，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平均有所升高（p<0.01；p<0.01；p<0.05），表明阿司匹林诱导大鼠胃黏膜产生炎症反应。与模型组相比，铁皮石斛水溶性总蛋白预保护使大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平明显降低，结果呈浓度依赖性，且高剂量组预保护后大鼠血清中IL-6水平高于对照组，表明铁皮石斛水溶性总蛋白对阿司匹林造成的炎症损伤有较好的保护作用。

3.4 铁皮石斛水溶性总蛋白对大鼠血清中氧化应激指标SOD、MDA水平的影响

大鼠血清中氧化应激指标SOD、MDA水平如表5所示。

表5 大鼠血清中氧化应激指标SOD、MDA水平（±s，n=10）Table 5 Oxidative stress indicators SOD，MDA levels in rat serum（±s，n=10）

表5 大鼠血清中氧化应激指标SOD、MDA水平（±s，n=10）Table 5 Oxidative stress indicators SOD，MDA levels in rat serum（±s，n=10）

注：与对照组相比##p<0.01表示差异极显著，#p<0.05表示差异显著；与模型组相比*p<0.05表示差异显著，**p<0.01表示差异极显著。

组别SOD/（ng/mL）MDA/（nmol/mL）空白对照组 7.55±1.34 20.12±2.77模型组 4.05±0.48#39.78±1.38##铁皮石斛水溶性总蛋白低剂量组 4.61±1.88 19.49±0.83**铁皮石斛水溶性总蛋白高剂量组 6.18±0.18**14.41±2.7**奥美拉唑组 6.12±0.8**17.71±3.58*

与对照组相比，模型组大鼠SOD含量有所下降（p<0.05）、MDA含量明显升高（p<0.01），表明阿司匹林引起了胃黏膜的氧化损伤。与模型组相比，铁皮石斛水溶性总蛋白预保护使SOD含量逐渐上升、MDA含量明显下降，且高剂量组效果最明显，结果均具有极显著差异，表明铁皮石斛水溶性总蛋白对阿司匹林诱导的胃黏膜氧化损伤有一定的保护作用。

3.5 铁皮石斛水溶性总蛋白对大鼠胃组织中COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA 表达的影响

大鼠胃组织中 COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达如图2所示。

图2 大鼠胃组织中COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达Fig.2 mRNA expression of COX-2，IL-1β，IL-6 and TNF-α in rat gastric tissue

与对照组相比，模型组大鼠胃组织COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表达明显上调，且均具有极显著差异（p＜0.01）；铁皮石斛水溶性总蛋白预处理后可使胃组织中 COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA 表达下调，且随着药物浓度升高作用效果更明显。表明铁皮石斛水溶性总蛋白能对阿司匹林诱导的大鼠胃黏膜损伤及炎症反应起到一定程度的保护作用。

3.6 铁皮石斛水溶性总蛋白对大鼠胃组织中COX-2蛋白表达的影响

COX-2蛋白表达如图3所示。

图3 大鼠胃组织COX-2蛋白表达Fig.3 COX-2 protein expression in rat stomach tissue

与对照组相比，模型组大鼠胃组织COX-2蛋白明显上调（p＜0.01），铁皮石斛水溶性总蛋白预处理后，COX-2蛋白有明显下调，且结果均具有极显著差异（p＜0.01，p＜0.01），表明铁皮石斛水溶性总蛋白通过下调COX-2蛋白表达量起到保护胃黏膜损伤的作用。

3.7 铁皮石斛水溶性总蛋白对大鼠胃组织中Erk1/2、pErk1/2蛋白表达的影响

Erk1/2、pErk1/2蛋白表达如图4所示。

与对照组相比，模型组大鼠胃组织中Erk1/2/pErk1/2的比值明显上调（p＜0.01），表明发生胃黏膜损伤时Erk1/2通路被激活，从而起到保护胃黏膜损伤的作用。经铁皮石斛水溶性总蛋白预处理后，Erk1/2/pErk1/2有明显下调，且结果均具有极显著差异（p＜0.01），表明铁皮石斛水溶性总蛋白通过激活Erk1/2通路起到保护胃黏膜损伤的作用。

4 讨论

图4 大鼠胃组织中Erk1/2、pErk1/2蛋白表达Fig.4 Erk1/2，pErk1/2 protein expression in rat gastric tissue

历代中医古籍中多有石斛“厚肠胃”相关功效的报道，作为临床常用的“胃肠药”，其“益胃”功效得到广泛认可。国内早期研究报道，铁皮石斛对胃黏膜损伤有较好的保护作用[15-17]，但目前多数研究集中于铁皮石斛多糖对胃黏膜损伤的保护作用[18]，对铁皮石斛水溶性总蛋白的相关研究未见报道。本文通过阿司匹林诱导大鼠急性胃黏膜损伤模型，对铁皮石斛水溶性总蛋白保护大鼠急性胃损伤及炎症反应的机制进行初步研究。

现代研究发现胃黏膜具有由防御因子组成的“胃黏膜防御屏障”体系：黏液－碳酸氢盐屏障、黏膜屏障、表皮生长因子、前列腺素等，它们相互协调，共同对抗攻击因子对胃黏膜的损伤。目前对NSAIDs造成的胃黏膜损伤机制尚未完全阐明，但其发生、发展必定是一个复杂的、多因素综合的过程，与氧自由基、炎症因子等攻击因子增强以及前列腺素等保护因子的减弱外有关[19-22]。

PGE2是人体中的一种重要细胞生长因子，可增加胃黏液的分泌量及胃黏膜血流量，继而增强胃黏膜抗损伤能力。COX-2是体内重要的炎症调节因子，参与介导前列腺素的产生，是PGE2合成的限速酶，在正常的多数体内细胞中并不表达，或者仅仅是少量表达于胃壁相关细胞或内皮细胞中，与IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子在胃损伤导致炎症反应中起协同作用。除炎症反应外，氧化应激也是胃溃疡发生的重要基质，胃黏膜损伤时可能引起机体产生氧化应激反应，导致血清中SOD含量减少，MDA含量增加，机体内氧化与抗氧化之间的平衡被破坏，造成中性粒细胞炎性浸润，最终导致组织、细胞氧化损伤的病理过程[23]。Erk1/2作为MAPK中的一员，对调控应激炎症反应具有重要作用，可被一系列细胞外的刺激信号激活并介导信号从细胞膜向细胞核传导，参与胃黏膜上皮增殖、分化等过程的调节，诸多报道证实激活Erk1/2通路对大鼠胃损伤愈合过程具有重要意义[24-26]。Erk1/2通路的激活不仅可促进胃黏膜细胞的增殖，而且还可以与PGE2共同作用，增加胃黏膜血流量，促进胃黏膜损伤的修复。

本实验通过采用阿司匹林灌胃5 h的造模方法建立了大鼠急性胃黏膜损伤模型，通过ELISA、RT-PCR等方法对大鼠血清及胃组织中的炎症因子进行检测，发现模型组炎症因子水平有明显上调，证明阿司匹林造成的胃黏膜损伤伴有严重的炎症反应，同时对SOD及MDA含量进行检测，发现模型组SOD含量减少，MDA含量增加，表明此时机体发生氧化应激反应；经铁皮石斛水溶性总蛋白预处理后，上述反应有明显好转，炎症因子水平随着给药剂量明显下调，SOD含量有所上调，MDA含量有所下调，表明机体炎症反应及氧化应激反应有明显减少，证实了铁皮石斛水溶性总蛋白对胃黏膜的预保护作用。为了进一步探讨其作用机制，采用WB法对COX-2以及Erk1/2、pErk1/2 3个因子的水平进行了检测，发现模型组有明显上调，给药组随着剂量逐渐下调，表明COX-2/Erk1/2通路被激活，可能通过促进胃黏膜细胞增殖等作用达到保护胃黏膜的作用。综上所述，铁皮石斛水溶性总蛋白对胃黏膜损伤的保护机制可能与增强PGE2等胃黏膜保护因子，增加胃黏膜血流量，清除氧自由基，降低炎症反应介质的含量以及激活Erk1/2通路使胃黏膜细胞增殖有关，但更深入的机制研究还需要进一步探讨。