毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达1)

杨帅 黄颖 王志英 刁桂萍

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

林木病虫害给我国林业的可持续健康发展带来巨大的威胁，也给我国经济造成巨大损失。目前对林木病虫害的主要防治措施仍以化学防治为主。化学药剂虽然在短期内能够起到杀灭病虫害的作用，但长期使用会引起抗药性、造成环境污染，同时也会杀伤天敌、破坏生态平衡，并对人类产生危害。植物蛋白酶抑制剂(PI)是一类能够抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白质，在贮藏组织中及植物的地上部分均有表达[1]。研究证实，当植物受到昆虫和病原菌侵染后，能诱导产生大量植物蛋白酶抑制剂干扰昆虫的消化过程，同时蛋白酶抑制剂在植物体内大量的积累亦能够诱导其产生防御机制来对抗病原菌的侵入[2-4]。丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)是植物蛋白酶抑制剂中种类最多、分布最广，兼具抗病虫效果的一类蛋白酶抑制剂[5]。早在1954年，Lipke et al.[6]就发现大豆中的丝氨酸蛋白酶抑制剂对杂拟谷盗(Triboriamconfusum)表现出毒性。Yoo et al.[7]的研究发现，在桃蚜(Myzuspersicae)侵染笋瓜(Cucurbitamaxima)过程中，其韧皮部内丝氨酸蛋白酶抑制剂的质量浓度有所增加，说明丝氨酸蛋白酶抑制剂可能在笋瓜抵御桃蚜侵袭中起作用。雷舒[8]通过对比不同抗虫茶树品种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达模式，认为丝氨酸蛋白酶抑制剂在茶树抵御昆虫取食中起重要作用。王裕鹏等[9]鉴定了川桑(Morusnotabilis)中的丝氨酸蛋白酶抑制剂并对其表达模式进行了分析，认为这些蛋白在桑树防御昆虫取食的过程中起重要作用。王洁华等[10]研究结果表明，转黑杨(Poplusnigra)丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PnKTIA6的拟南芥(Arabidopsisthaliana)对小菜蛾(Plutellaxylostella)具有较高抗性。Qu et al.[11]发现过表达丝氨酸蛋白酶抑制剂基因RBBI2-3提高了转基因植株对稻瘟病病原菌(Pyriculariaoryzae)的抗性。除此之外，研究还发现SPI在植物产生效应器-激发的免疫性过程中起作用，但相关研究[12-14]并不深入。迄今为止，针对植物丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究主要集中在豆科(Leguminosae)、茄科(Solanaceae)以及禾本科(Poaceae)植物上[15-16]，对于木本植物丝氨酸蛋白酶的研究，特别是对于作为木本模式植物的杨树SPI的功能研究十分稀少。本研究利用PCR技术从毛果杨(Populustrichocarpa)中分离获得1条丝氨酸蛋白酶基因PtrSPI，将其构建到分泌型真核表达载体pPIC9K中，并转化获得转基因毕赤酵母，诱导获得重组蛋白表达，为后期获取大量具有活性的重组毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂及深入研究其功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

毛果杨组培苗由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室提供；真核表达载体菌株TOP10F′-pPIC9K由东北林业大学森林保护重点实验室提供；大肠杆菌TOP10感受态购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 毛果杨PtrSPI基因的克隆与序列分析

通过NCBI的ORF查找器寻找毛果杨PtrSPI基因的开放读码框；利用ProtParam软件预测蛋白分子质量和等电点；运用BlastP对毛果杨PtrSPI基因编码的氨基酸序列进行保守区预测及同源性搜索，选取15个与毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列相近的丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列进行多序列比对；使用Swiss-model软件预测蛋白质的三维结构；利用ProtScale在线分析(http://web.expasy.org/protscale/)预测蛋白疏水性；用MEGA5.0软件构建进化树。

1.3 毛果杨PtrSPI基因真核表达载体构建

根据毛果杨PtrSPI基因序列以及真核表达载体pPIC9K序列设计引物，并交由上海生工生物技术服务有限公司合成：Sp1，5′-ATCGGAATTCATGGATCTCCGTGACTCGATC-3′(下划线处为EcoRI酶切位点)；Sp2，5′-CGATGCGGCCGCATTGGCCTGTGAGGGGTCGAG-3′(下划线处为NotI酶切位点)。

以毛果杨cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。将扩增产物胶回收后，用限制性内切酶EcoRI和NotI对PCR回收产物和质粒pPICK进行双酶切，并用T4 DNA Ligase连接后转入大肠杆菌TOP10感受态中，获得重组表达载体pPIC9K-PtrSPI。

1.4 重组表达载体pPIC9K-PtrSPI转化毕赤酵母及其转化子筛选

电转化法将重组质粒pPIC9K-PtrSPI转入到毕赤酵母GS115感受态中，然后涂布于RDB平板(不加组氨酸)上，30 ℃恒温培养至长出单菌落。随机挑取单菌落进行摇菌，分别取10 μL菌液点在含不同质量浓度遗传霉素(0、0.50、0.75、1.00、1.50、1.75 g·L-1)的YPD平板上培养，然后从含有高质量浓度遗传霉素G418的平板上挑取5个转化子放入BMGY培养基中，30 ℃恒温振荡培养后，提取转基因毕赤酵母基因组DNA，并进行PCR检测。

1.5 真核重组蛋白的诱导表达

将上述获得的阳性转化子接种于BMGY培养基中，30 ℃恒温振荡培养至菌液OD600为2～6。吸取一定量菌液于100 mL BMMY培养基(含终质量分数0.5%甲醇)中至OD600=1，置于30 ℃恒温振荡培养，诱导24 h后取样，使用密理博蛋白纯化柱过滤除杂蛋白后用于SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，以空载体作为对照。

2 结果与分析

2.1 毛果杨PtrSPI基因全长cDNA获得与生物信息学

毛果杨PtrSPI基因的cDNA编码区序列全长为1 176 bp，共可编码391个氨基酸(图1)。使用ProtParam软件预测该蛋白的相对分子质量为42 648.45，理论等电点为5.21。亚细胞定位于细胞质中。

NCBI的BlastP对毛果杨PtrSPI基因编码的氨基酸序列进行保守区预测，从图2A可知，该蛋白属于SERPIN超家族，具有该家族的保守区结构域。ProtScale软件分析结果显示(图2B)，氨基酸残基的疏水性(正值表明疏水，负值表明亲水)平均值(GRAVY)为-0.044 08，表明该蛋白具有亲水性。使用Swiss-model软件对蛋白进行三维结构预测，结果如图2C所示，该蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的结构特征，由8～9个α螺旋和3个β片层构成，含有裂口区、闭合区、A-sheet区域及反应中心环(RCL)。其中，RCL上的铰链区对Serpin的构象变化起着重要调控作用[17]。

2.2 毛果杨PtrSPI多序列比对及进化树分析

用NCBI的BlastP对PtrSPI基因进行同源性搜索，在GenBank数据库中与毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的氨基酸序列匹配的序列共有100个，同源性为64%～92%。选取与该基因的氨基酸序列相似性较高的15个序列，进行多序列比对(图3)。ClustalW比对结果表明，毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的氨基酸序列与胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高，达到92%，且这16个氨基酸序列C端均含有高度保守的RCL氨基酸序列，其P12-P9为保守的氨基酸序列AAAA，P14位点为T，P15位点为G。

将毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与其他15条丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列用MEGA5.0进行进化树分析，结果见图4。16条序列被分为6个分支，其中毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列与胡杨丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列亲缘关系最近，并与2个橡胶树丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列(XP_021648006和XP_021642770)共同位于第1分支。此外，柑橘属植物中的丝氨酸蛋白酶抑制剂均位于第3分支，亲缘关系较近。

2.3 毛果杨PtrSPI基因真核表达载体的构建

对已构建的毛果杨PtrSPI基因真核表达载体进行菌液PCR检测。从图5可见，在1176bp左右出现了特异条带，初步证明目的基因已与真核载体pPIC9K连接成功。将PCR检测成功的菌液进行测序，测序结果表明真核重组载体构建成功。

*表示同源。XP_006375008为毛果杨(Populustrichocarpa)；XP_011030699为胡杨(P.euphratica)；XP_021648006为橡胶(Heveabrasiliensis)；XP_012071718为麻风树(Jatrophacurcas)；XP_021642770为橡胶；XP_007017373为可可树(Theobromacacao)；XP_010059775为巨桉(Eucalyptusgrandis)；XP_009364054为梨(Pyrus×bretschneideri)；XP_010089933为苹果(Morusnotabilis)；XP_023906656为欧洲栓皮栎(Quercussuber)；XP_021820930为樱桃(Prunusavium)；XP_008378534为苜蓿(Malusdomestica)；PSS17234为中华猕猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensis)；XP_006473392为甜柳橙(Citrussinensis)；XP_006434870为柑橘(C.clementina)；GAY39438为蜜柑(C.unshiu)。

图3毛果杨PtrSPI蛋白多序列比对

2.4 毕赤酵母转化子的筛选与鉴定

从不含组氨酸的RDB培养基上随机挑取转化子，将其分别接种到含有不同终质量浓度遗传霉素G418的YPD培养基上，置于30 ℃恒温培养5～7 d，对照为未转化毕赤酵母菌株。由图6可知，在含有终质量浓度为0、0.50、0.75 g·L-1G418的YPD平板上只有少数转化子不生长，含终质量浓度为1.0、1.5 g·L-1G418的YPD平板上只有一小部分转化子生长，而在终质量浓度为1.75 g·L-1G418的YPD平板上几乎无转化子生长。

在含终质量浓度为1.50 g·L-1G418的YPD平板上随机挑取5个单菌落，摇菌后提取酵母基因组DNA进行PCR检测。PCR结果显示(图7)，在1 628 bp处扩增出特异条带(包括载体长度452 bp)，与预期结果一致，表明重组质粒pPIC9K-PtSPI已经成功转化毕赤酵母GS115中。

2.5 重组蛋白的诱导表达

毕赤酵母重组转化菌株GS115-PtrSPI用甲醇诱导24 h后，收集菌液离心后取上清液，使用密理博蛋白纯化柱去除杂蛋白后进行SDS-PAGE电泳检测。由图8可见，电泳结果显示在42 648.45处检测到特异蛋白条带，与预期结果相符。而在对照转化菌株中无此条带。说明毛果杨PtrSPI基因成功整合到毕赤酵母基因组中，并顺利表达。

A.G418终质量浓度为0；B.G418终质量浓度为0.50 g·L-1；C.G418终质量浓度为0.75 g·L-1；D.G418终质量浓度为1.00 g·L-1；E.G418终质量浓度为1.50 g·L-1；F.G418终质量浓度为1.75 g·L-1。

图6酵母转化子的筛选

1.诱导24 h酵母转化子GS115-PtrSPI；2.诱导24 h的对照转化子GS115-pPIC9K；M.蛋白质分子质量标准。

图8毕赤酵母重组蛋白的SDS-PAGE检测

3 结论与讨论

植物丝氨酸蛋白酶抑制剂能够在植物抵御病虫害中起重要作用，但是对于其诱导植物产生抗性的机制尚不清楚。直接从植物体中分离获取大量天然的PtrSPI蛋白研究其功能十分困难且繁琐，需经过抽提、去杂蛋白、盐析及层析等多个过程[18]，因此通过基因工程技术获得大量重组SPI蛋白是研究其功能的前提。

目前而言，获取重组蛋白的方式主要有2种。一是利用大肠杆菌原核表达系统进行重组表达。该方式的优势在于重组菌株构建容易，重组蛋白产量高，发酵条件经济可控，缺点则是重组蛋白往往形成无活性的包涵体，必须经过复性后才能后续应用。杜霸[19]使用原核表达体系对水稻丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白OsSerpin进行了异源表达，并通过对重组蛋白的变性、复性及分离纯化等过程后仍未获得具有活性的重组蛋白。二是利用酵母进行的真核表达系统。其优势在于重组蛋白表达量高、分泌效率高、杂蛋白含量少。张燕青[20]使用毕赤酵母真核表达系统对大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白S2T1进行了异源表达，通过对分离纯化获得的重组蛋白功能进行鉴定发现其对胰蛋白酶及枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)均有较强的抑制作用。可见，使用真核表达系统能够更高效的获得具有活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂。本研究克隆了毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI，并通过毕赤酵母表达系统成功获取了毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂PtrSPI重组蛋白，为后续分离纯化并研究该蛋白功能奠定基础。