施永德
(复旦大学上海医学院生物物理学教研室,上海 200032)
给某一个系统施加力时,这系统就会给出相应的反应力。前者是作用力,后者是反作用力。这一对力之间存在着某种依赖性,也存在着某种差异性。通过这一对力的分析,可知该系统的物质结构在受力过程中的变化,从而推知这一系统物质所具有的功能。举一个最简单的例子,如用手把一把榔头对某块大岩石用力一敲,岩石的反作用力会把手上“虎口”振的非常疼痛,说明岩石的结构非常坚硬;如用手把同一榔头对于某块棉花毯一敲,棉花毯的反作用力很弱,不会把手上“虎口”振痛,说明棉花毯的结构非常柔软。从这一个简单的例子,可说明对于某一系统给以作用力与其反作用力的分析,可以知道物质的结构及其与功能的关系。岩石也好、棉花毯也好,这是大型的、人们所熟悉的东西与常识而已,不举这个例子普通人们也知道其原理和常识。然而对于人体的细胞、血液、精液、植物的匀浆液、蛋白质、核酸等生物物质的力学滞后环与屈服应力而言,就有不同研究的价值了。所谓力学滞后环,是不仅观察作用力与反作用力之间的力量数值上的差异,而且还要观察作用力与反作用力之间在时间上、数值上存在着互相滞后与衰减的差异。把所给的作用力由小至大、反作用力发生数值与时间的关系,同时将其逆向过程也连续地记录下来,根据这一记录结果可以画出该系统的力学滞后环的图形,又根据滞后环的形状和曲线走向,可以推知系统内物质的结构和能量变化的关系。力学滞后环技术是一项高技术,它涉及到所给作用力数值自动控制与记录、反作用力产生数值系列的自动记录、以及与时间、温度等多维数据实时采集,有计算机与信息技术发展的今天,就能更妥善精密实现。此外医学生物学所研究的对象,往往是所取样品十分宝贵、索取样品量又少、所给样品系统的作用力是非常微小的(大了就把样品本身搞坏了),力小难以精确定量化、相应地其反作用力的数值也微量化,因此这项技术在医学生物学中的研究,与工程学上相比,增加了难度,往往被传统医学生物学工作者所忽略。本文拟将血液、精液、含羞草匀浆液此三种力学滞后环的特点做比较,说明该技术在医学生物学中有利用与普及的价值。
需给一个样品系统施加应力(或切变率)与时间呈三角波的伺服系统(如图1),也即给测定系统施加由零应力(或切变率)开始,按照一定时间间隔,逐步上升到一个最大值;然后按同一时间间隔,由此应力(或切变率)最大值退回至零。在此过程中,记录下给测定系统施加力数值、系统内部对此作反应的力、系统的温度与时间的对应记录。这些数据的采集若有计算机控制下自动实现,就更加容易些。本文部分实验结果是采用上海航天局矫树魁高级工程师为首所研制的空气轴承HT流变仪和美国Brookfield所提供的计算机程序型DVⅡ流变仪而实现的。上海、国内和国际的行家,有足够能力达到以上水平。
图1 切变率(或应力)时控三角波伺服系统示意图
3.1 方法 将施加切变率的顺序为横坐标、将记录下的系统内部给出反作用应力作为纵坐标,进行作图,看这些图中的曲线的走向与数值,就可以用滞后环的理论推测被测物质在力作用下结构的变化以及推测其所具有的功能。
3.2 分类与理论基础 以理论和作者结合实验室的测定结果,力学滞后环可分为5类。5个类型的理论上曲线走向说明,以及力作用下系统内物质结构的变化的预测和系统内能量变化:Ⅰ.顺时针走向的单环:系统耗散外加作用力的能量(即所围面积为能量密度速度的和),系统内物质结构由聚集变为分散,体系内部发生柔化和稀化(图2A);Ⅱ.逆时针走向的单环:系统内增加的能量,系统内物质结构由分散变为聚集,由颗粒形成三维网络结构,体系内部发生稠化或固化(图2B);Ⅲ.“8”字形走向的双环,中间有一个临界交点,近零处为逆时针走向(解释与Ⅱ相一致),远零处为顺时针走向(解释与Ⅰ相一致)(图2C);Ⅳ.“8”字形走向的双环,近零处为顺时针走向,远零处为逆时针走向(虽然可如此推论,但作者尚未测定到过如此情景的材料)(图2D);Ⅴ.无环型,即上升线与下降线为完全重合的直线,如纯水测定结果就是如此,说明在力的作用下,系统结构和理化性质没任何改变(图2E)。
图2 力学滞后环的分类及理论基础示意图
5个类型中,作者的实验室,除了Ⅳ类型以外,其他几种类型已有过实验记录,从下文的血液、精液、含羞草匀浆液的力学滞后环记录,可知道其各自的特点。
滞后环技术与被测定系统的屈服应力测定是结合在一起的。当切变率三角波由零逐步增大至最大设计值,然后由最大设计值切变率回归到0 s-1时,如果此时被测系统还存在着应力的话,就与纵坐标大于零处相交。其交点的应力值这就是屈服应力值。对于流体而言屈服应力可以定义为:切变率回归为0 s-1时的所具有剪切应力(也可以说系统发生变形与流动的最小应力)。图3示如何用滞后环的三角波终点回归法,获得屈服应力的直接测定的示意图。当滞后环的下降线回归终点时与纵坐标发生相交,其交点的纵坐标应力值,就是直接读到的屈服应力值,图中300 mPa就是被测样本的屈服应力值,箭头示滞后环的走向,为了说明该法的原理,该图的数字是人工模拟数值。
图3 滞后环三角波终点法获得屈服应力值直接测定的示意图
血液滞后环属于图2中的Ⅲ型, 即“8”字形走向的双环,中间有一个临界交点,近零处为逆时针走向,远零处为顺时针走向。在上世纪70年代Huang和Fabisiak[1]测定了血液滞后环,由于技术条件的限制,他们只测定到远零处为顺时针走向环,根据实验结果建立Huang氏全血流变学方程。到了上世纪80年代陈叔奇和梁子钧[2]报道,他们不仅远零处测定到顺时针走向环,也测定到近零处的逆时针走向环,两个环之间的临界点切变率为1~2 s-1,并对以上方程提出了修正意见。在上世纪90年代,本文作者实验室对一系列健康人和缺血性中风病人进行了测定和比较,与陈叔奇和梁子钧的报道基本上是一致的,同时方波和江体乾[3]用动力学方法拟合出4参数的全血流变学方程来表达整个滞后环的走向。本文将作者实验室的测定结果与临床应用做过如下工作大致描述如下[4]。测定正常男性30 名、女性14 名;缺血性中风病人男性25 例、女性17 例。实验采用的仪器是上海航天局矫树魁高级工程师为首所研制的空气轴承HT流变仪(该技术曾获上海市科学技术一等奖,荣获国家科学技术二等奖)。图4为女性缺血性中风病人与女性正常人血液滞后环形态平均值的比较,由于男性情况也相近,故在本文中不再列入。从其“8”字形滞后环的形态可以提取出有价值数据。如“8”字形滞后环的中间交叉点,将之分为两个环,近零处是一个逆时针环(这代表着物体吸收了能量或增加了能量,实际上就是红细胞在切变率或剪切力为零时形成缗钱体结构,使血液具有黏弹性体的反应性),而远零处是一个顺时针环(这代表着物体耗散了外加的能量,该能量来自流变仪转动马达,实际上就是红细胞缗钱体在切变率或剪切力较大时把缗钱体结构打散的作用,而形成较小的缗钱体或单个的红细胞的反映),中间的临界交叉点对于正常男女来说切变率约为1 s-1,而缺血性中风病人则为1.4 s-1,增加了40%。对于滞后环所围面积而言,它代表着所涉及的能量密度速度的大小。对于近零处的逆时针滞后环而言,正常人男性为0.17 erg·cm-3·s-1,而男性缺血性中风病人为0.39 erg·cm-3·s-1,后者增加了130%;正常人女性为0.09 erg·cm-3·s-1,而女性缺血性中风病人为0.19 erg·cm-3·s-1,后者增加了111%。以上结果表明缺血性中风患者的红细胞形成巨大缗钱体的能力很强(形成缗钱体体积大、形成速度快、吸收能量多)。对于远零处的顺时针滞后环而言,正常人男性为0.15 erg·cm-3·s-1,而男性缺血性中风病人为0.40 erg·cm-3·s-1,后者增加了167%;正常人女性为0.15 erg·cm-3·s-1,而女性缺血性中风病人为0.28 erg·cm-3·s-1,后者增加了87%。以上结果表明缺血性中风患者的红细胞缗钱体要分散为小个的缗钱体或单个红细胞所需要的能量,要比正常人大得多(因为红细胞在通过微小血管时必须以单个红细胞才能够通过)。至于个别病例,以上两个参数可以比正常人高出几倍、几十倍、几百倍。如此的情况如果发生在未发生缺血性中风之前,这种对象预先处理好,这就避免发生缺血性中风。
此外,缺血性中风患者的血液滞后环的位置明显往高上升的,这说明血液在流动的过程中,所消耗的能量明显增加,其消耗的能量可以分为两部分,一部分为维持血液由黏弹性物体变为可流动的流体所消耗的能量,另一部分为消耗于流体流动过程中克服内摩擦力所消耗的能量。
对于前者而言,就是与血液的屈服应力有关。滞后环技术的另一特别之处,可以直接测定被测液体的屈服应力。血液也有屈服应力,在各人之间是有差别的。我们应用上文已经提到的滞后环三角波终点回归法,获得屈服应力直接测定。当滞后环的下降线回归终点时与纵坐标发生相交,其交点的纵坐标应力值,就是直接读到的屈服应力值。如此从图4的滞后环曲线与纵坐标相交的交点可以读出该值,即正常女性的屈服应力是12 mPa,而缺血性中风患者的屈服应力是20.7 mPa,后者比前者增加了73%。同样根据作者实验室的研究资料示,男性正常人屈服应力平均值为16 mPa,缺血性中风病人的平均值为26.4 mPa,后者增加了65%。也就是说缺血性中风患者要维持自己的血液具有流动性,要比正常人多付出60%~70%的能量。图4中可见,以纵坐标0~屈服应力值这一段为一边,与横坐标为另一边,所构成的矩形面积,就是心脏付出要让血液具有流动性的能量密度速度的总和,这些能量均来自于自己心脏的搏动,并维持至生命的终结。因此脑血管病、任何血管病不能不与心功能连在一起的。图5示正常人与缺血性中风病人的屈服应力值的比较,可以看出病人组的屈服应力值明显高于正常人60%~70%,说明病人的心脏要比正常人多负担60%~70%的能量消耗。
图4 缺血性中风病人(系列2,17 例)与正常人(系列1,14 名)血液滞后环形态平均值的比较
图5 正常人与缺血性中风病人的屈服应力值的比较
至于后者,即消耗于流体流动过程中克服内摩擦力所消耗的能量部分,就是图3中曲线下的这一块面积,除去前所述的屈服应力矩形面积以外的其他部分面积,就代表着其所消耗的能量密度速度。可以看出其面积缺血性中风患者要比对照组的大得多,这一结果也具有保健价值,因为偏离对照组过高,应该加以预防与治疗。此外从理论上说,同样对照组或疾病组自身而言,其上升线与下降线是有些区别的,上升线总体来说所围面积要比下降线所围面积大些,其原因在于切变率上升过程中,红细胞缗钱体驱散成单个红细胞或较小缗钱体的过程需要消耗能量,在下降过程中具有滞后作用与惯性作用,不能够按时地复聚回到届时的上升线状态,因此消耗的能量比较小些。其原因是切变率归零附近时,红细胞群体突然地出现形成缗钱体的高潮,需要补偿消耗能量,这就致使上升线与下降线所围的面积差别。曲线下的面积又可以分为曲线下的非线性与线性的两部分,施伟等[5]已经分别地进行了处理,并将非线性部分实现了连续反应动力学的数值解, 对这“8”字形的滞后环的理论物理意义作了理论与实际应用的解释。
至于正常男女性别之间,存在着某种差异,原因是女性在具有生育年龄期间,红细胞压积低10%左右,因此女性要比男性下降一些,但是差别不是很大的。到了女性丧失生育能力后,红细胞压积几乎男女均等,此时男女差别几乎就没有。
以上血液滞后环的图形就是一个正常与异常的比较,掌握了滞后环的基本知识后,就可以知道其血液循环中的体液部分属于正常还是异常,它是一个具有深厚物理学理论基础的工具。就是物理学基础不太好的,看看滞后环的图形与正常人的比较,也可领会其中医学生物学的价值,因此在科学发展的今天,该技术是可以推广与普及的。
以上工作的完成要感谢华山医院秦芝九、唐镇生、吕传真等教授与作者一起在上世纪90年代,向卫生部申请关于“脑血管病的血液流变学研究”基金共同完成工作的一部分内容,同时得到上海航天局矫树魁高级工程师在仪器上的支持,这仪器属于上海市第九人民医院血液科杨景文和乐忠庆医务专家研究室的设备,病人来自华山医院与中山医院的急症室,由如上单位和合作者共同完成的。
人类精液是繁衍人类自己的最重要生命物质,如果人类精液的质量存在着问题,人类自己的繁衍肯定受到了影响。因此人类精液的质量研究是人类科学研究中的重要课题。以往研究精液的质量总是强调生物化学和细胞生物学的方法,而忽视应用物理学和力学的方法,其实后者是影响因素最小的条件下进行的。为此本文作者课题组采用力学滞后环技术来检测健康父亲的精液特点。测定仪器是采用美国Brookfield流变仪公司的电脑程序式DVⅡ型流变仪,切变率调节在0-1-0 s-1三角波,用该公司提供的软件,在Windows下进一步自己编制自动采样程序,实现应力、切变率、时间、温度的多维自动采样。精液采样取自健康父亲,采用手淫方法放精,精液直接射在流变仪的测量杯中,每1 分钟测量1 个滞后环,一直测定20 min,实现了连续20 个滞后环的测定,结果如图6所示[6]。
图6 射精后1~20 min内,同一精液的滞后环的每分钟所测定的图像,由于5~20 min的滞后环互相重叠在一起,将在图8、图9、图10分别加以表达
从图6可见:第1分钟的滞后环属于逆时针滞后环,由于应力超出仪器测量范围,故测定半途中,仪器自动终止测定,但是可以计算出其屈服应力在3 000~4 000 mPa,滞后环所围面积意味着液体流动过程中所需要的能量密度速度,第1分钟的滞后环所围的面积至少为20.90 erg·cm-3·s-1,意味着精液以此能量密度速度值吸收了能量,展示此时的精液明显地属于黏弹性体的;第2分钟的滞后环可以完整测出,它是一个典型的逆时针滞后环,其屈服应力约为2 000 mPa,所围的面积是13.89 erg·cm-3·s-1,故而是黏弹性体;第3分钟,它也是一个典型的逆时针滞后环,其屈服应力约为843 mPa,所围的面积是4.12 erg·cm-3·s-1,故而也是黏弹性体。但是到了第4分钟时,其典型的逆时针滞后环大大消失,所围的面积大大减少,其屈服应力大大变小,故而已属于流体。第5分钟及其以后,几乎所有滞后环相差不太大,互相重叠一起。由此可以想象出以下情景:精液储藏在男人精囊里时,其周围的介质是属于黏弹性体,它可以从介质里吸取营养,但是其行动是受到限制的,其实精子在积蓄力量,等待射精以后,当精液在4~5 min内液化后,精子开始游向卵细胞并与卵细胞结合受精,发育成为新的个体。也就是说男人的射精这一力学行为,立即启动了精液由静止过渡到精子发生强力活动的状态,男人的射精力如同催化剂一样,启动了精液的生物学、物理学与化学性质的大改变,至少在我们的实验结果里,展示出在5 min之内,由黏弹性体变为液体,有利于精子游动至卵细胞附近实现受精与人类繁殖的功能。图7示精液射出后,滞后环试验中读出屈服应力值,由近4 000~5 000 mPa之大,在4~5 min下降为50 mPa左右的情景(由于其中0 min与1 min的屈服应力的数值已经超出仪器测定范围,其值是根据直线类推出来的。
图7 精液射出后滞后环试验读出屈服应力值由近4 000~6 000 mPa在4~5 min下降为50 mPa左右情景
由于图6中的滞后环曲线互相重叠在一起,本文拟将其中某些滞后环图形分别绘制,做些有价值的比较。如图8示精液被男人射出后在20 min内的滞后环曾经有过三种类型的滞后环。1~3 min为逆时针环(图中来自第3分钟的滞后环数据);3~4 min,远零处有如此机会:滞后环合并为一条直线形状,但是近零处仍保留有逆时针环(图中数据是模拟的);4~20 min后为“8”字形滞后环(切变率0.2~0.4 s-1时有一分界点。右边为顺时针环,左边仍为逆时针环),此时液体在远零处示触变性流体,近零处示黏弹性流体,因为液体中有精子与精液的液化介质的蛋白质或蛋白质解体后的产物充分存在,使之不会完全地失去其触变性与黏弹性这两种共有的性质。
图8 精液被男人射出后在20 min内的滞后环有三种类型的示意图
由于图6中的20 个滞后环曲线互相重叠一起,故图9按照精液射出的时间,分别取2、3、4、5、10、20 min的滞后环画图,可见0~3 min是属于逆时针环的,4 min以后则为“8”字形双环。前者,呈现为精液属于黏弹性体;后者,具有双重性,远零处属于触变性流体,近零处属于黏弹性体。说明后者的精液已经更具有流动性了。由于4 min后的曲线仍然互相重叠,为此图10再做一次改善。
图9 按照精液射出时间来分,0~3 min之前是属于逆时针环的,4 min起则为“8”字形双环。前者示全滞后环呈现为精液属于黏弹性体。后者则不同,远零处具有触变性流体,近零处属于黏弹性体。由于图6中4~20 min的曲线滞后环互相叠在一起,故本图选择如上6 个曲线滞后环作展示,但是4 min后曲线仍然互相重叠,为此图10再做一次改善。
图10 在5 min以后出现“8”字形双环滞后环作图时,互相拥挤一起看不清其变化趋势,为此在此图选择5、10、20 min时的同类“8”字形环列出,可看出其趋势是:随着分钟数的延长,双环间的分界点逐步向切变率零处靠拢,远零处的顺时针环所围面积逐步减少,近零处的逆时针环所围面积也逐步减少,意味着液体的触变性与黏弹性随时间的延长均逐步下降,但是并不完全地消失,因为液体中有精子与精液的液化介质的蛋白质与蛋白质解体的产物充分存在,使液体保持留存应有的触变性与黏弹性。
由于在图6中,5 min以后出现“8”字形双环滞后环作图时,互相拥挤看不清其变化趋势,为此在图10选择了5、10、20 min时滞后环作比较,可看出其趋势是:随着分钟数的延长,双环间的分界点逐步向切变率零处靠拢,远零处的顺时针环所围面积逐步减少,近零处的逆时针环所围面积也逐步减少,意味着液体的触变性与黏弹性随时间的延长均逐步下降,但是并不完全地消失,因为液体中有精子与精液的液化介质中的蛋白质与解体蛋白质产物的充分存在,使液体保持着留存的应有的触变性与黏弹性。
健康父亲的精液必须具有如此的双重性质:射精之前具有高屈服应力的黏弹性,射精后具有在4~5 min就液化成屈服应力只有30 mPa左右的流体。没有这双重性,就会失去生育能力。这一性质的双重性表现在:精液在男人的精囊里,是安放在具有黏弹性网络结构中,精子可以吸取营养,但是它的行动是受到限制的,因人类的繁殖需要精子积蓄力量,等到男人射出精液至女方阴道后、并精液液化后,方让精子强烈地游动,实现其“两万五千里的长征”,达到卵细胞处,并钻入卵细胞实现受精,需知参与这种“两万五千里的长征”的精子有上亿个,只有其中第一个游动冠军实现自然选择,钻进了卵细胞实现了繁衍生育下一代的功能,而其他的精子都被卵细胞发出蛋白质信号,通知他们均成为淘汰品。男人的射精的力作用,还触动了精液内部的一系列蛋白酶的激活,将构成网络体系的精液液体中的蛋白质长肽链结构,剪切为小肽链或氨基酸,此时尽快地拆掉保护精子的蛋白质网络体系,放精子们充分地出游,尽快游动去寻找卵细胞实现受精。如果男人的精液在射精以前,在精囊里就已经很稀薄,其精子已经在精囊里自由活动着,其能量以及能量的来源已经消耗掉,射精后的“两万五千里的长征”就不能够做到,如此就失去了生育能力;另一方面即使精液在精囊里也好、射出后也好都很厚,具有充分的黏弹性,如果没有在约5 min实现液化,继续保持具有网络性的黏弹性体,那么精子也不能够实现其“两万五千里的长征”的游动能力实现受精的。滞后环技术妥善地揭示了人类自生繁衍的力学条件,这种技术可以成为今后男性精液健康与否的标志。这种精液的功能和行为是人类和哺乳类动物长期进化的结果。本工作受到当时在上海博康生殖医院工作的汪四七博士的合作与支持。
作者从事生物物理学教学时,课上当论及什么是物质的触变性时说,物质在力的作用下发生了性质的改变,这就是触变性。学生们不能理解如此解释触变性的定义。作者再补充说如同含羞草一样,在小小的力的作用下,叶子就垂了下去;如果没有力的作用,含羞草又恢复为原来样子,这种因为力的作用而变化,撤去力的作用又恢复原样的性质,就是触变性。如此解释后学生们就理解了什么是触变性。然而含羞草为什么会受力而动,也在中国的科普著作“十万个为什么”中解释为,含羞草受力以后其叶柄的背侧渗透压提高,而其腹侧渗透压下降所致。但作者退休以后,亲自种了含羞草,用含羞草叶浆做其滞后环试验,其结果是与“十万个为什么”中的解释是不同的。实验方法是将含羞草的叶子和叶柄用蒸馏水做成匀浆,采用美国Brookfield流变仪公司的电脑程序式DVⅡ型流变仪,切变率调节在0-1-0 s-1、0-2-0 s-1、0-4-0 s-1、0-6-0 s-1、0-10-0 s-1多种三角波,用该公司提供的软件,在Windows下进一步自己编制自动采样程序,实现应力、切变率、时间、温度的多维自动采样,以完成各种滞后环的测定。其中0-1-0 s-1的三角波作用下的滞后环如图11,由于其他切变率三角波的图像有雷同,本文就不再列出了[7]。
图11 植物含羞草(A)、猪骨骼肌肉(B)、植物叶下珠(C)三种匀浆悬浮液(浓度均为压实体积的15%)的滞后环的比较
图12示在0-1-0 s-1三角波作用下三种匀浆液滞后环读出的屈服应力值的比较,可以看出只有含羞草匀浆液明显产生屈服应力值,而其他两种不明显。而且图13示其屈服应力值随着三角波切变率的峰值程度增加而增加着,说明含羞草匀浆液在如此三角波切变率条件下是属于剪切硬化的流体。图13横坐标为6种切变率三角波的类型,如0-0.1-0示三角波由0 s-1逐步上升为0.1 s-1,然后又从0.1 s-1退回至0 s-1,其余即类推。
图12 在0-1-0 s-1三角波作用下三种匀浆液滞后环读出的屈服应力值的比较
图13 含羞草在6种切变率三角波作用下读出的屈服应力值
切变率范围:本文研究滞后环,在血液用0-5-0 s-1的三角波,在精液为0-1-0 s-1三角波,含羞草匀浆液用的最低为0-0.1-0 s-1的三角波,最高用的0-4-0 s-1三角波,说明样品切变率不宜太高。茅福成作为上海市卫生局的官方检测血液流变学指标标准化时列出的数据[8],有的厂商与医院采用切变率有高达200 s-1。在如此高的程度,估计有的红细胞已被切碎。本文滞后环试验没有采用如此高的切变率,否则以上3种物质的结构也好,触变性也好,聚集性也好,是测不出来了的。对生物样品而言,太高不仅测不出原有的流变学行为,而且损坏样品原有性质。流变学测定中,用什么切变率要看样品,如工程学上的水泥与混凝土,用很高的切变率;但生物样品,如用太高的切变率,恰恰起到相反的作用(而低切变率技术的实现,是流变学中更难的),本文的资料也有参考价值。
滞后环与屈服应力具有明确的物理意义,对之能否测定也是对仪器与技术的一种评价,优质的流变仪可以测定。建议很多单位在用流变仪过程中,检测样品的滞后环与屈服应力是否也可以,进行这种尝试是无害的。
不管是什么物质,只要在力的作用下,有物质结构的改变,即可以通过滞后环技术检测出来,在此介绍给读者参考,尝试今后在医学生物学中是否具有应用价值。但其分子结构水平上的变化,需要分子生物学、结构生物学、细胞生物学、生物化学、蛋白质或细胞骨架等技术加以配合,共同来确定。