樱柏酸对叔丁基过氧化氢诱导SH-SY5Y神经细胞氧化应激损伤的保护作用*

鄢黎，何乡，马泽康，李沛波，苏薇薇

(中山大学生命科学学院/广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州 510275)

近年来，人口老龄化日趋严重，与衰老密切相关的疾病如神经退行性疾病已进入高发期[1]。这类疾病严重的影响人们的身心健康，也给家庭和社会带来了沉重的负担，已然是目前亟待解决的关键问题。神经退行性疾病的发病机理错综复杂，其中衰老引发的氧化应激和自由基损伤是重要因素[2]。氧化应激是指机体系统细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量增加，导致自由基失衡而引发细胞整体功能的退化和丧失[3]。自由基会对神经细胞造成脂质过氧化、生物膜损伤、核酸断裂交联损伤、蛋白质损伤等一系列影响，诱发细胞损伤及凋亡[4]。因此，寻找具有抗氧化应激作用的药物对于延缓衰老及相关疾病的防治具有重要的临床意义。

大量研究表明天然药物中存在多种具有抗氧化活性的物质，包括二萜类、多酚类、维生素类等小分子化合物。这类化合物具有来源广泛，疗效显著，毒副作用低，生物利用度高等诸多优点[5]。本课题组前期从具有益智和神经保护作用的传统中药柏子仁中分离出二萜类活性单体樱柏酸(communic acid, COM)，研究发现其对TBHP诱导的SH-SY5Y 细胞氧化应激损伤具有保护作用，但作用机制不明[6]。本研究将系统研究樱柏酸抗氧化应激的作用及机制，以期为樱柏酸治疗神经退行性疾病提供相应的实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人神经瘤细胞母细胞SH-SY5Y(购自中国医学科学院基础科学研究所)；叔丁基过氧化氢(SIGMA-ALDRICH)；樱柏酸(上海远慕)；MTS试剂盒(Promega)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天，P0009)；乳酸脱氢酶检测试剂盒(南京建成，A020-2)；超氧化物歧化酶测试盒(南京建成，A001-3)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒(南京建成，A005)；活性氧(ROS)测试盒(南京建成，E004)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天，C0602)；人8-OHdG酶联免疫试剂盒(武汉华美)。

1.2 实验方法

1.2.1 SH-SY5Y细胞的培养 人神经瘤细胞母细胞株SH-SY5Y培养w=10%胎牛血清和w=1%双抗(青/链霉素)的DMEM/High Glucose培养基，37 ℃、含φ=5% CO2的细胞培养箱中，常规传代培养。

1.2.2 叔丁基过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型的建立 用含有不同浓度TBHP的培养基常规培养细胞，TBHP终浓度分别为20、40、80和160 μmol/L；MTS法检测：SH-SY5Y细胞经各浓度TBHP处理24 h后，每孔加入20 μL Celltiter 96®AQueous 工作液，37 ℃培养箱中孵育1 h，之后用酶标仪检测490 nm处的吸光度(A490)；计算SH-SY5Y细胞存活率。

细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

式中，As：实验孔(含有细胞的培养基，TBHP)；Ac：对照孔(含有细胞的培养基，不含TBHP)；Ab：空白孔(不含细胞和TBHP的培养基)。选择细胞存活率约50%时浓度的TBHP处理SH-SY5Y细胞24h构建氧化应激损伤模型。

1.2.3 染色检测β-半乳糖苷酶 6孔板接种分组处理后，吸去细胞培养上清液，PBS缓冲液洗涤1次，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，吸出固定液并用PBS缓冲液洗涤3次、每次3 min，吸去PBS缓冲液，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃避光封闭过夜，显微镜下计数β-半乳糖苷酶染色细胞比例。

1.2.4 LDH释放检测 6孔板接种分组处理后收集细胞培养上清液，3 000 r/min离心15 min，取上清待测；LDH试剂盒检测：设定空白孔，加入25 μL双蒸水；设定标准孔，加入5 μL双蒸水和20 μL标准液；设定测定孔加入20 μL待测样本和5 μL辅酶I；设定对照孔，加入5 μL双蒸水和20 μL待测样本。每孔加入25 μL基质缓冲液，混匀后37 ℃温育15 min，加入2,4-二硝基苯肼25 μL，混匀后37 ℃温育15 min，加入250 μL 0.4 mol/L的 NaOH溶液，混匀后室温放置5 min，用酶标仪检测450 nm吸光度。

1.2.5 樱柏酸对TBHP诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响 用含樱柏酸和80 μmol/L的TBHP培养基培养SH-SY5Y细胞24 h，樱柏酸浓度分别为4、8、16 μmol/L，每组设6个复孔；每孔加入20 μL Celltiter 96®AQueous 工作液，37 ℃培养箱中孵育1 h，之后用酶标仪检测490 nm吸光度，计算SH-SY5Y细胞存活率。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期的SH-SY5Y细胞，经胰酶消化离心后用培养基重悬，显微镜下计数，以1×105/孔接种于6孔板，实验分为6组：空白对照组、模型组(80 μmol/L TBHP)、低剂量组(4 μmol/L樱柏酸+80 μmol/L TBHP)、中剂量组(8 μmol/L樱柏酸+80 μmol/L TBHP)、高剂量组(16 μmol/L樱柏酸+80 μmol/L TBHP)、阳性对照组(8 μmol/L白藜芦醇+80 μmol/L TBHP)；细胞过夜贴壁后，进行相关处理，培养24 h后，收集细胞：吸去上清液，用胰酶消化并收集贴壁细胞，PBS洗涤细胞一次，重悬计数10万细胞，1 500 r/min离心5 min；染色：加入195 μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，混匀，室温下避光孵育15 min；流式细胞仪上机检测：通过FITC通道(FL1)检测Annexin V-FITC的绿色荧光，FL3通道检测PI的红色荧光。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞内ROS水平 6孔板接种分组处理后，培养24 h，收集细胞：吸去上清液，用胰酶消化并收集贴壁细胞，PBS洗涤细胞一次并重悬细胞；染色：每孔加入1 μL DCFH-DA，混匀，于37 ℃下避光孵育30 min；流式细胞仪上机检测。

1.2.8 ELISA法检测DNA损伤程度 分组处理后收集细胞培养上清液，3 000 r/min离心15 min，取上清待测；ELISA法检测：室温平衡试剂30 min，并用去离子水按1∶20比例稀释浓洗涤液，设定空白对照孔不做处理；设定标准孔加50 μL标准品，每个浓度设立2孔；设定检测孔加入50 μL待测样品。除空白对照孔外，每孔加入酶结合底物50 μL，不干胶封片，于37 ℃孵育1 h，手工洗板3次，每孔加入50 μL显色液A和50 μL显色液B，混匀后避光显色15 min。每孔加入50 μL终止液，用酶标仪检测450 nm吸光度。

1.2.9 细胞内SOD酶活力检测 6孔板接种分组处理后，细胞裂解液裂解细胞，离心收集上清，用BCA法测定蛋白浓度。设定对照孔、空白对照孔、测定孔和测定空白孔，加入200 μL底物应用液，混匀后37 ℃孵育20 min，用酶标仪检测450 nm吸光度。

1.2.10 细胞内GSH-Px酶活力检测 6孔板接种分组处理后，冰浴下用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心收集上清，用BCA法测定蛋白浓度。设定对照管和测定管，加入试剂进行酶促反应，混匀后，3 500 r/min离心10 min，取1 mL上清液设定空白管、标准管、对照管和测定管作显色反应，混匀后室温静置15 min，用酶标仪检测412 nm吸光度。

1.3 统计学分析

实验数据均以均数±标准误(mean±S.E.M)表示，采用SPSS16.0 分析软件对结果进行统计处理，用单因素方差分析(one-way ANOVA)做多组比较及组间两两比较。经方差齐性检验后，方差齐同采用Bonferroni 法，方差不齐用Tamhane’s 法，以检验各组间差异的显著性。P<0.05 则认为存在显著性差异。

2 结 果

2.1 构建TBHP诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型

用40、80和160 μmol/L的TBHP作用于SH-SY5Y细胞24 h后，检测细胞存活率，结果如图1所示：与空白组相比，40、80、160 μmol/L TBHP均降低SH-SY5Y细胞存活率，且呈剂量依赖性，具有统计学意义(P<0.01)；其中80 μmol/L组损伤率约为50%，因此后续实验以80 μmol/L的TBHP作用SH-SY5Y细胞24 h，作为构建细胞氧化应激损伤模型的条件。

图1 TBHP对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig.1 The influence of TBHP on cell viability of SH-SY5Y cells 与空白组相比:##P<0. 01 ## P<0.01 compared with control group, values represent means±S.E.M, n=4

2.2 樱柏酸对TBHP损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响

MTS法检测细胞存活率，结果如图2所示，与空白组相比，模型组细胞存活率降低，差异有统计学意义(P﹤0.01)；与模型组相比，中高剂量组樱柏酸能提高TBHP诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激模型的细胞存活率，差异有统计学意义(P﹤0.05)。

图2 樱柏酸对TBHP所诱导SH-SY5Y 细胞氧化应激损伤的保护作用Fig.2 Protective effect of communic acid on oxidative stress injury of SH-SY5Y cell induced by TBHP 与空白组相比:##P<0. 01;与模型组相比：*P<0.05 ##P<0.01 compared with control group; *P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

2.3 樱柏酸改善TBHP诱导SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞衰老

染色检测细胞衰老，结果如图3所示：与空白对照组相比，模型组衰老细胞比例和程度增加；和模型组相比，中高剂量组樱柏酸能降低TBHP诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激模型衰老细胞比例和衰老程度，差异有统计学意义(P﹤0.05)。

2.4 樱柏酸减轻TBHP诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞膜的损伤

检测各组细胞培养上清液LDH含量，结果如图4所示：与空白对照组相比，模型组LDH含量升高，差异有统计学意义(P﹤0.05)；与模型组相比，樱柏酸能减少TBHP诱导SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞LDH释放，差异有统计学意义(P﹤0.05)。

2.5 樱柏酸抑制TBHP诱导的SH-SY5Y细胞凋亡

通过Annexin V-FITC/PI染色后进行流式细胞仪检测检测细胞凋亡率，结果如图5所示：与空白对照组相比，模型组晚期细胞凋亡率增高(P﹤0.01)；与模型组相比，中高剂量组樱柏酸能降低TBHP诱导的SH-SY5Y细胞晚期细胞凋亡率，差异有统计学意义(P﹤0.05)。

图3 樱柏酸改善TBHP诱导的SH-SY5Y细胞衰老Fig.3 Communic acid improves cell senescence in SH-SY5Y cells induced by TBHP(A)空白组；(B)模型组(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L樱柏酸)；(D)中剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L樱柏酸)；(E)高剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L樱柏酸)；(F)阳性药组(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜芦醇)；与空白组相比:##P<0. 01; 与模型组相比：*P<0.05(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F):positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES),##P<0.01 compared with control group;*P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

图4 LDH法检测樱柏酸对TBHP 诱导损伤的SH-SY5Y细胞活性影响Fig.4 The effect of communic acid on TBHP-treated SH-SY5Y cells by LDH assay 与空白组相比:#P<0. 05; 与模型组相比：*P<0.05 #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

2.6 樱柏酸减少TBHP诱导SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞内ROS水平

用DCFH-DA 染料处理细胞，经流式细胞仪检测细胞内ROS水平，结果如图6所示：与空白对照组相比，模型组细胞细胞内ROS水平显著增；与模型组相比，4 μmol/L樱柏酸能降低TBHP诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞内ROS水平(P﹤0.05)，中高剂量组细胞内ROS水平显著性降低(P﹤0.01)。

2.7 樱柏酸减轻TBHP诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞DNA损伤

检测细胞培养上清液中8-OHdG含量，结果如图6所示：与空白对照组相比，模型组细胞培养上清液中8-OHdG含量增加；与模型组相比，樱柏酸能降低TBHP诱导SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞培养上清液中8-OHdG的含量，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义(P﹤0.01)。

图5 樱柏酸抑制TBHP诱导SH-SY5Y细胞凋亡Fig.5 Communic acid against apoptosis of SH-SY5Y cells induced by TBHP(A)空白组；(B)模型组(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L樱柏酸)；(D)中剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L樱柏酸)；(E)高剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L樱柏酸)；(F)阳性药组(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜芦醇)；与空白组相比:#P<0. 05; 与模型组相比：*P<0.05(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F) positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES),##P<0.01 compared with control group;*P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=3

图6 樱柏酸降低TBHP诱导SH-SY5Y细胞内ROS水平Fig.6 Communic acid decreases the intracellular ROS level on TBHP-induced ROS accumulation in SH-SY5Y cells(A)空白组；(B)模型组(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L樱柏酸)；(D)中剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L樱柏酸)；(E)高剂量组(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L樱柏酸)；(F)阳性药组(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜芦醇)；与空白组相比: #P<0.05; 与模型组相比：*P<0.05,**P<0.01(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F) positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES), ##P<0.01 compared with control group;*P<0.05,**P<0.01 compared with model; group values represent means±S.E.M,n=3

2.8 樱柏酸提高TBHP诱导SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞抗氧化系统能力

检测细胞内SOD和GSH-Px酶活力，结果如图8所示：与空白对照组相比，模型组SOD和GSH-Px酶活力降低；与模型组相比，中高剂量组樱柏酸能提高TBHP诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激模型细胞内SOD和GSH-Px酶活力，差异有统计学意义(P﹤0.05)。

3 讨 论

氧化应激诱导细胞产生ROS所介导的生物分子损伤会导致细胞凋亡及衰老，是诱发衰老及神经退行性疾病的关键因素[7]。因此，使用抗氧化剂抑制ROS的产生是延缓衰老及治疗氧化应激相关疾病的有效途径。叔丁基过氧化氢(TBHP)是一种常见的过氧化物，产生的羟自由基可引起脂质过氧化反应，刺激大量ROS生成，导致细胞氧化应激损伤，目前被广泛用于氧化应激损伤模型的建立[8]。

图7 樱柏酸减轻TBHP诱导 SH-SY5Y细胞DNA损伤Fig.7 Communic acid inhibits 8-OHdG generate of SH-SY5Y cells induced by TBHP 与空白组相比:##P<0. 01; 与模型组相比：**P<0.01 ##P<0.01 compared with control group;**P<0.01 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=3

图8 樱柏酸提高TBHP诱导 SH-SY5Y细胞内抗氧化酶活力Fig.8 Communic acid increases intracellular antioxidant enzyme activity in SH-SY5Y cells induced by TBHP(A) 樱柏酸对SH-SY5Y细胞内SOD活性的影响;(B) 樱柏酸对SH-SY5Y细胞GSH-Px活性的影响；与空白组相比:##P<0. 01; 与模型组相比：*P<0.05(A)Effect of Communic acid on intracellular SOD activity in SH-SY5Y cells; (B) Effect of Communic acid on intracellular GSH-Px activity in SH-SY5Y cells.## P<0.01 compared with control group;* P<0.05 compared with model group; values represent means±S.E.M, n=3

樱柏酸是广泛存在于松柏类植物的活性单体。文献报道，樱柏酸能通过抑制MMP-1的表达来防止胶原蛋白降解，具有抗皮肤光老化作用[9]。本课题组前期研究发现樱柏酸对神经细胞具有保护作用，故本实验选用80 μmol/L TBHP 作用SH-SY5Y细胞24 h建立氧化应激损伤模型，来研究樱柏酸抗氧化应激损伤的作用及机制，并使用天然抗氧化剂白藜芦醇作为阳性对照药[10-11]。β-半乳糖苷酶是评价衰老的重要指标，通过染色检测其染色率和染色程度研究樱柏酸对TBHP诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤模型细胞衰老比例和细胞衰老程度的影响，结果表明，樱柏酸能延缓TBHP诱导SH-SY5Y氧化应激损伤模型细胞衰老。因此，樱柏酸具有潜在抗氧化应激损伤延缓细胞衰老的作用。本研究通过MTS法检测细胞活性，结果显示樱柏酸能提高细胞的活性。为了进一步研究樱柏酸的抗氧化应激损伤作用，本实验通过检测细胞外乳酸脱氢酶(LDH)的释放量，来考察细胞膜的完整性，结果再次证实樱柏酸能明显提高氧化应激损伤细胞的活性。氧化应激造成的损伤最终导致细胞凋亡[12]，因此本实验检测了细胞的凋亡率。结果表明，樱柏酸可以抑制TBHP诱导的细胞凋亡。由此可见，樱柏酸对TBHP诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤具有保护作用。

ROS是导致细胞活性下降和细胞膜损伤的关键因素[13]，本研究发现樱柏酸能降低细胞内ROS水平。ROS引起的DNA过氧化会导致基因突变，影响转录因子的结合和微管的稳定性。8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是指示DNA碱基对的改变的特异性物质[14]。本实验通过测定细胞培养上清中8-OHdG的含量，来考察细胞DNA氧化应激损伤的程度。结果表明，樱柏酸能减轻氧化应激所致的SH-SY5Y细胞DNA损伤。同时，机体抗氧化系统的失衡也会导致氧化应激损伤。超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)是人体代谢产生的内源性抗氧化剂，在生理水平下能抑制ROS的产生，维持人体代谢平衡，延缓衰老及预防各种神经退行性疾病的发生[15]。而随着机体的衰老，体内SOD和GSH-Px的含量大幅下降，最终导致各类慢性病的产生，如能及时补充外源性的抗氧化剂，抑制体内SOD和GSH-Px含量的减少，能有效抑制ROS氧化应激损伤，进而减缓机体衰老进程及预防神经退行性疾病的发生[16]。本实验对细胞内 SOD 和 GSH-Px 的活力检测结果显示，樱柏酸能提高体内抗氧化酶 SOD 和GSH-Px 的含量。说明樱柏酸能通过增强细胞自身对氧化应激的防御能力，来起到保护细胞抗氧化应激损伤的作用。

综上所述，本研究发现樱柏酸减轻TBHP诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤及延缓细胞衰老进程，其作用机制可能通过减少ROS对细胞膜和DNA等氧化应激损伤、同时提高体内源性氧化剂SOD和GSH-Px活力起效。本研究有助于阐明樱柏酸作为天然抗氧化剂抗细胞损伤延缓衰老的作用机制，为进一步开发治疗氧化应激相关疾病和抗衰老药物等临床药物的提供了相关理论及实验依据，具有重要的社会和经济价值。