海南东寨港红树林内生真菌Fusarium sp.的含氮代谢产物*

陈晓晴，梁翠芳，林慧美，赵嘉愉，黄楚榆，陶移文

(广州医科大学药学院，广东 广州 511436)

红树林是生长在热带或亚热带潮间带，兼顾海洋和陆地特点的潮滩湿地木本生物群落，其高盐度、高温、潮湿、高度微生物和动物的竞争等极端的环境条件使其许多内生真菌可以产生多种结构独特、具有药理活性的代谢产物[1-2]。镰刀菌属是一大类广泛分布在土壤和植物体内的丝状真菌，能产生丰富多样的具有抗癌、抗菌、抗氧化等功能的活性次级代谢产物，如萜类、聚酮类、非核糖体多肽类等[3]，尤以真菌毒素如伏马毒素、伊快霉素、恩镰孢菌素、镰孢菌素、白僵菌素等化合物的活性显著[4]。前期试验表明，来源海南省东寨港自然保护区红树植物的内生真菌Fusariumsp. KL11次级代谢产物具有显著的抗肿瘤细胞活性，值得深入研究。本课题组以KL11为出发菌株，经发酵培养、分离纯化和结构解析鉴定，得到6个含氮类化合物，分别是bassiatin(1)，白僵菌素(2)，葡萄孢镰菌素(3)，5-甲氧基葡萄孢镰菌素(4)，8-甲氧基葡萄孢镰菌素(5)和5，8-二甲氧基葡萄孢镰菌素(6)(图1)。

图1 化合物1～6的结构Fig.1 The structure of compounds 1～6

1 仪器与材料

超净工作台(苏州苏洁净化有限公司，SJ-CJ-2FDQ型)；高压蒸汽灭菌锅(日本松下健康医疗器械株式会社，MLS-3781L-PC)；摇床(上海紫裕生物)；旋转蒸发仪(上海霄汉实业发展有限公司)；薄层色谱硅胶GF254和柱色谱用硅胶(青岛海洋化工厂有限公司)；400NB核磁共振波谱仪(日本电子株式会社)；6460三重四级杆液质联用质谱仪(美国Agilent公司)；XSCANS单晶衍射仪(美国Bruker公司)；LC-20A高效液相系统(日本岛津株式会社)；LC-10A高效液相系统(日本岛津株式会社)；SSI二元高效液相系统(美国LabAlliance公司)；常规试剂均为分析纯。

实验用菌株KL11采自海南东寨港红树林树叶，菌株分离纯化，经形态观察和基因序列分析，鉴定为Fusariumsp.。该菌种现保存于广州医科大学药学院。

2 提取与分离

菌株Fusariumsp. KL11经PDA固体培养基复苏，GPY(葡萄糖-蛋白胨-酵母膏)液体培养基中放大培养，然后接种于珍珠米固体培养基，常温静置培养44 d；发酵终止，用3倍体积甲醇溶剂浸泡，减压浓缩，得到粗提浓缩液；浓缩液经等体积乙酸乙酯溶剂反复萃取三次，合并有机相，减压浓缩干燥，获得乙酸乙酯粗提物(134.14 g)；乙酸乙酯粗提物经硅胶(200～300目)柱层析分离，依次采用三倍柱体积的φ=100%正己烷(A)、φ=90%正己烷/φ=10%乙酸乙酯(B)、φ=80%正己烷/φ=20%乙酸乙酯(C)、φ=60%正己烷/φ=40%乙酸乙酯(D)、φ=40%正己烷/φ=60%乙酸乙酯(E)、φ=20%正己烷/φ=80%乙酸乙酯(F)、φ=100%乙酸乙酯(G)、φ=80%乙酸乙酯/φ=20%甲醇(H)和φ=100%甲醇(I)进行梯度洗脱，获得9个不同极性段的组分(A～I)；随后，结合细胞活性结果，对组分E和F反复柱层析，凝胶柱层析，薄层层析和反相中压制备后，得到6个含氮类化合物。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉状固体，分离得到0.094 3 g，ESI-MSm/z: 262.2 [M+H]+，结合NMR数据，推断其分子式为C15H19NO3，不饱和度为7。详细数据如下：1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ：7.24 (1H，d，J= 3.9 Hz)，7.23～7.15 (2H，m)，7.02 (1H, t，J= 11.9 Hz)，6.82 (1H，d，J= 8.4 Hz)，5.65 (1H，dd，J= 20.3，8.2 Hz)，4.88～4.68 (1H，m)，3.11～3.02 (3H，m)，1.89 (1H，dt，J= 13.7，6.9 Hz)，0.81 (3H，dd，J= 14.6，8.2 Hz)，0.40～0.29 (3H，m)；13C NMR (CDCl3，101 MHz )δ：170.0，129.6，128.8，127.1，115.9，76.1，34.8，32.0，30.0，18.6，17.1。与文献[5]数据比对，化合物1鉴定为bassiatin。X-单晶衍射结果进一步确证该化合物结构(图2)。

图2 化合物1的晶体结构Fig.2 The crystal structure of compound 1

化合物2：白色方块状结晶，分离得5.133 2 g。ESI-MSm/z: 784.8 [M+H]+，结合NMR数据，推断其分子式为C45H57N3O9，不饱和度为19。详细数据如下：1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ：7.29～7.21 (5H，m)，7.21～7.15 (1H，m)，5.44 (1H，dd，J= 12.2，4.7 Hz)，4.82 (1H，d，J= 9.1 Hz)，3.22～3.12 (2H，m)，3.03 (3H，s)，1.81～1.71 (1H，m)，0.76 (3H，d，J= 6.6 Hz)，0.20 (3H，d，J= 6.8 Hz)；13C NMR (DMSO-d6，101 MHz)δ：169.5，169.3，136.8，128.8，128.4，126.6，74.7，48.7，34.0，31.4，29.6，18.3，16.4。与文献[6]数据比对，化合物2鉴定为白僵菌素。

化合物3： 红色粉末状固体，ESI-MSm/z: 286.4 [M+H]+，结合 NMR数据，推断其分子式为 C15H11NO5，不饱和度为11。详细数据如下：1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：13.49 (1H，s)，13.20 (1H，s)，9.50 (1H，s)，7.96(1H，s)，6.76(1H，s)，4.02 (3H，s)，2.80 (3H，s)；13C NMR (CDCl3，101 MHz )δ：186.4，183.9，165.4，161.3，157.9，151.2，143.3，138.7，124.6，118.0，107.9，56.8，25.3。与文献[7]数据比对，化合物3鉴定为葡萄孢镰菌素。

化合物4： 红色粉末状固体，ESI-MSm/z: 300.4 [M+H]+，结合NMR数据，推断其分子式为 C16H13NO5，不饱和度为11。详细数据如下：1H NMR (CDCl3，300 MHz)δ：9.15 (1H，s)，7.85 (1H，s)，7.08 (1H, s)，4.01(3H，s)，3.96 (3H，s)，2.68 (3H，s)；13C NMR (CDCl3，75 MHz)δ：189.2, 178.8, 164.2, 156.6,155.6, 149.2, 148.3, 138.2, 126.2, 117.4, 116.1，111.5, 107.5, 58.0，57.4, 25.2。与文献[8]数据比对，化合物4鉴定为5-甲氧基葡萄孢镰菌素。

化合物5： 橙红色针状固体，ESI-MSm/z: 300.4 [M+H]+，结合NMR数据，推断其分子式为 C16H13NO5，不饱和度为11。详细数据如下：1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δ：9.17 (1H，s)，7.87 (1H，s)，7.19 (1H，s)，4.02 (3H，s)，3.97 (3H，s)，2.68 (3H，s)；13C NMR (DMSO-d6，101 MHz)δ：188.8，178.3，163.5，160.0，155.0，148.5，148.0，137.7，125.6，117.0，115.3，110.0，105.6，56.9，56.7，24.5。与文献[9]数据比对，化合物5鉴定为8-甲氧基葡萄孢镰菌素。

化合物6：黄色粉状固体，ESI-MSm/z: 314.4 [M+H]+，结合NMR数据，推断其分子式为 C17H15NO5，不饱和度为11。详细数据如下：1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ：9.35 (1H，s)，7.75 (1H，s)，6.85 (1H，s)，4.05 (3H，s)，4.02 (3H，s)，3.95 (3H，s)，2.73 (3H，s)；13C NMR (CDCl3，101 MHz)δ：183.4，181.0，164.1，160.1，158.9，149.4，144.1，139.4，125.5，117.6，115.7，114.3，102.4，61.7，57.0，56.5，25.2。与文献[10]数据比对，化合物6鉴定为5，8-二甲氧基葡萄孢镰菌素。

4 结果和讨论

从内生真菌Fusariumsp. KL11的发酵粗提取物中共分离并鉴定6个含氮化合物，分别是Bassiatin(1)，白僵菌素(2)，葡萄孢镰菌素(3)，5-甲氧基葡萄孢镰菌素(4)，8-甲氧基葡萄孢镰菌素(5)和5，8-二甲氧基葡萄孢镰菌素(6)。化合物1和2为环酯肽类化合物，而化合物3，4，5和6为系列葡萄孢镰菌素类化合物。药理活性表明，化合物1为血小板聚集抑制剂[5]；化合物2具有良好的抗细菌[11]、抗真菌[11]、抗病毒[12]和抗肿瘤活性[13-14]，其中抗肿瘤活性尤受关注。最近文献报道[14]，化合物2对人类视网膜母细胞瘤Y79、乳腺癌细胞C6、人肝癌细胞Hep-G2、单核细胞淋巴瘤细胞U-937等40多种细胞系均呈现出不同程度的细胞毒性，IC50范围为0.5～30 μmol/L。作用机理研究表明[15]，化合物2可以通过抑制NF-κB信号传导、阻断ERK(extracellular signal-regulated kinase)信号通路和激活JNK(c-Jun N-terminal kinase)信号通路，从而诱导细胞凋亡。因此，化合物2是一种具有潜在抗肿瘤活性的天然化合物；化合物3在体外有强烈抑制结核杆菌生长的作用[16]；化合物4，5和6未发现其明显的活性[17]。

菌株KL11作为化合物2的高产菌株(产率达3.8%)，有望通过不同研究战略(如添加外源性分子底物及设计不同类型培养基等手段)，优化培养条件，提高化合物2的产量，降低生产成本。同时，微生物活性代谢产物的发酵培养，符合绿色经济环保、可持续发展的理念，可将该菌株作为工程菌进行工业生产，创造巨大的经济效益。