低氧下K562细胞向红系分化进程中GATA-1与miR-451a表达的相关性研究*

付成冰，刘 芳，牛志鹏，胡彩艳

（青海大学医学院 1高原医学研究中心，2生物化学教研室，青海西宁810000）

GATA结合蛋白1（GATA binding protein-1，GATA-1）是调控红系分化过程不可或缺的转录因子［1］，它可通过调节微小 RNA（microRNA），如 microRNA-451a（miR-451a），实现对红系分化的精细调控。miR-451a主要富集在成熟红细胞内［2-3］，其在红系的表达水平明显高于其它链系，且随着红系分化过程持续升高［4］，动物和体外红系分化模型均证实miR-451a有助于红细胞成熟［5-6］，提示miR-451a是调控红系分化的特异性microRNA。

低氧环境能促进骨髓造血干细胞向红系定向分化，结果使骨髓红系前体细胞增多［7-8］。低氧条件下大鼠骨髓CD71+细胞内GATA-1的表达显著高于对照组，表明低氧能诱发GATA-1的高表达［9］。然而，低氧条件下GATA-1与miR-451a的相关性及其在红系分化过程中的作用还不明确。本项工作以低氧条件下人慢性髓细胞性白血病K562细胞红系分化模型为研究对象［10］，检测GATA-1和miR-451a在低氧下表达的变化趋势，并分析两者表达的相关性，为阐释GATA-1可能通过调控miR-451a参与促进低氧下红细胞分化过程提供实验依据。

材料和方法

1 试剂与仪器

K562细胞购自中国科学院上海细胞研究所。RPMI-1640培养液购自HyClone；胎牛血清购自四季青公司；氯化血红素（hemin chloride）购自北京索莱宝科技有限公司；总RNA提取试剂盒（DP419）、miRNA提取试剂盒（DP501）、miRNA逆转录试剂盒（KR211-02）和miRNA荧光定量PCR试剂盒（208054）均购自TIANGEN；RNA逆转录试剂盒（K1622）、BCA蛋白定量试剂盒和RNA荧光定量试剂盒（160025891）购自Thermo Fisher Scientific；兔抗人GATA-1单克隆抗体（ab181544）和α-tubulin鼠单克隆抗体购自Abcam；山羊抗兔IgG（SA00001-2）购自 Proteintech；CD235a流式抗体 APC-Cy7（349116）和同型抗体（400230）购自BioLegend。所用引物均由上海生工生物技术公司合成，序列见表1。GATA-1过表达慢病毒（LV-GATA1，记为Up）和GATA-1过表达阴性对照慢病毒（LVCON238，记为NC-Up）、GATA-1干扰慢病毒［LV-GATA1-RNAi，记为Down］和GATA-1干扰阴性对照慢病毒（LVCON077，记为NC-Down）均购自上海吉凯基因科技有限公司。三气培养箱（Binder）；荧光显微镜（Zeiss）；PCR扩增仪（Eppendorf）；7500型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems）；流式细胞仪（Beckman）；Amersham Imager 600化学发光成像分析仪（GE Healthcare）。

2 方法

2.1 细胞培养及分化模型的建立 K562细胞培养于含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素和链霉素）的RPMI-1640培养液中，分为低氧（hypoxia）组和常氧（normoxia）组，以 5×107/L 的密度分别置于低氧（37℃、1%O2、94%N2、5%CO2、饱和湿度）和常氧（37℃、5%CO2、饱和湿度）培养箱。采用40 μmol/L hemin chloride诱导K562细胞分化至48和72 h。

2.2 Western blot检测GATA-1核蛋白的表达 提取细胞核蛋白，BCA法定量后取5 μg核蛋白进行10%SDS-PAGE；转膜后，5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃孵育GATA-1抗体（1∶10 000）过夜；0.1%TBST清洗后，加II抗（1∶10 000），室温封闭1 h，洗膜、显影曝光。以α-tubulin为内参照，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白条带灰度值/α-tubulin条带灰度值。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 RT-qPCR检测γ-globin和GATA-1 mRNA及miR-451a的表达

2.3.1 γ-globin和GATA-1 mRNA表达的检测 提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以β-actin为内参照，采用2-ΔΔCt方法检测γ-globin和GATA-1的mRNA表达。扩增参数为：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。每个样本重复3次。

2.3.2 miR-451a表达的检测 提取细胞总miRNA，以Oligo（dT）18为引物逆转录成cDNA。以U6为内参照，采用2-ΔΔCt方法检测miR-451a的表达。扩增参数为：95℃ 15 min；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40个循环。每个样本重复3次。

2.4 慢病毒感染 将对数生长期的K562细胞以5×107/L的密度接种于6孔板，取Up［滴度4×1011TU/L，感染复数（multiplicity of infection，MOI）=30］和NCUp（滴度 1×1012TU/L，MOI=30）感染 K562细胞，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养12 h后补加1 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，培养至96 h，荧光显微镜下观察病毒载体中插入的GFP表达情况。Down（滴度4×1011TU/L，MOI=30）和NC-Down（滴度1×1012TU/L，MOI=30）的感染方法同上。

2.5 流式细胞术检测CD235a的表达 CD235a，又称血型糖蛋白A（glycophorin A，GPA），是红系细胞表面特异性标志物，其表达量随红系分化逐步增高［11］。收集诱导后的细胞，用预冷的PBS清洗2遍，以1×1010/L重悬细胞。取100 μL细胞悬液加入5 μL CD235a抗体，室温避光孵育15 min。PBS清洗后，弃上清，用500 μL PBS重悬细胞，上机检测。

2.6 细胞染色

2.6.1 联苯胺染色 收集细胞，离心弃上清，用PBS清洗2遍后，500 μL PBS重悬。加联苯胺染液15 μL，3%H2O210 μL，3 min后加1 μL硝普钠溶液。取10 μL细胞悬液均匀在载玻片上，每个视野下大约200个细胞，计算阳性细胞百分比。未分化的细胞不着色，分化的细胞呈深蓝色。

2.6.2 瑞氏-吉姆萨染色 将收集的细胞均匀涂抹在载玻片上，滴加染液A（0.8～1.0 mL）覆盖整个涂抹区域，染色1 min；再滴加染液B（体积是A液的2～3倍），用吸耳球吹匀，染色约10 min。冲洗残存染液，晾干后镜下观察并进行图片采集。

3 统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，各组数据均用均数±标准差（mean±SD）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用Spearman进行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 K562细胞红系分化模型的复制

RT-qPCR结果显示，常氧组γ-globin的mRNA表达在48 h与0 h相比无显著性差异（P＞0.05），低氧组48 h其表达量显著高于0 h（P＜0.05）；两组γ-globin的mRNA表达在72 h表达均显著增高（P＜0.05），并且在72 h低氧组显著高于常氧组（P＜0.05），见图1A。与0 h相比，两组细胞联苯胺染色阳性率均显著升高（P＜0.05），且48和72 h低氧组联苯胺染色阳性率均显著高于常氧组（P＜0.01），见图1B。与0 h相比，两组细胞表面CD235a在48 h时表达均显著升高（P＜0.05）；72 h低氧组CD235a的表达显著高于常氧组（P＜0.01），见图1C。

2 GATA-1和miR-451a的表达

Western blot检测结果显示，48 h低氧组GATA-1蛋白的表达量与常氧组相比无显著差异（P＞0.05），72 h低氧组GATA-1蛋白的表达量显著高于常氧组（P＜0.05）；组内比较结果显示，低氧组GATA-1蛋白的表达量在72 h显著高于48 h（P＜0.05），常氧组GATA-1蛋白的表达量在48和72 h无显著差异（P＞0.05），见图2A。RT-qPCR结果显示，低氧组GATA-1 mRNA的表达量在72 h较48 h显著升高（P＜0.05），且显著高于常氧组（P＜0.05），常氧组在48和72 h无显著差异（P＞0.05），见图2B。miR-451a在低氧组72 h时表达显著增高（P＜0.05），且显著高于常氧组（P＜0.05），常氧组miR-451a的表达在48和72 h无显著差异（P＞0.05），见图2C。

Figure 1.The erythroid differentiation model of K562 cells was replicaed.A：the mRNA expression of γ-globin was detected by RT-qPCR；B：the positive cells of benzidine staining at 48 h and 72 h（scale bar=100 μm）；C：the expression of erythroid specific marker，glycophorin A（CD235a），was detected by flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 0 h.图1 K562细胞向红系分化模型的复制

3 低氧条件下GATA-1和miR-451a表达的相关性分析

相关性分析结果显示，低氧组GATA-1的mRNA表达与miR-451a的表达呈正相关，相关系数为r=0.850（P＜0.01），见图3。

4 低氧条件下过表达或干扰GATA-1的表达对红系分化的影响

4.1 过表达GATA-1可促进红系分化 与光学显微镜同一视野相比，荧光倒置显微镜显示，Up组90%以上细胞呈绿色荧光，见图4。Western blot检测过表达后GATA-1的表达量，结果显示，Up组出现双条带且表达量显著高于NC-Up组（P＜0.05），见图5。低氧下Up组γ-globin的表达在48和72 h均显著高于NC-Up组，见图6A。同时，联苯胺染色结果也显示GATA-1过表达可显著增加联苯胺阳性率（P＜0.05），见图6B。流式细胞术结果显示，低氧诱导72 h后Up组细胞表面CD235a的表达显著高于NC-Up组（P＜0.05），见图6C。细胞形态实验结果显示，Up组在48和72 h时体积增大、核偏移和核缩小的细胞数目均显著多于NC-Up组（P＜0.01），见图6D。

Figure 2.Expression of GATA-1 and miR-451a in the two groups.A：the protein expression of GATA-1 in the nucleus detected by Western blot（N：normoxia；H：hypoxia）；B：the mRNA expression of GATA-1 detected by RT-qPCR；C：the expression of miR-451a detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs normoxia group；#P＜0.05 vs 48 h.图2 GATA-1和miR-451a在两组细胞中的表达

Figure 3.Correlation analysis between GATA-1 and miR-451a under hypoxia.图3 GATA-1与miR-451a在低氧条件下的相关性分析

Figure 4.The fluorescence detection of GATA-1 over-expression lentivirus 96 h after infection（scale bar=50 μm）.A，B：NC-Up group；C，D：Up group.A，C：light microscopy；B，D：fluorescence microscopy.图4 GATA-1过表达慢病毒感染96 h后的荧光检测

Figure 5.The protein expression of GATA-1 in UP group and NC-Up group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Up group.图5 过表达慢病毒感染后GATA-1蛋白表达的检测

Figure 6.GATA-1 over-expression enhanced erythroid differentiation of the K562 cells under hypoxia condition.A：the relative mRNA expression of γ-globin detected by RT-qPCR；B：the results of benzidine staining（scale bar=100 μm）；C：the expression of CD235a detected by flow cytometry；D：the results of Wright-Giemsa staining（scale bar=10 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC-Up group.图6 低氧下过表达GATA-1后促进红系分化

4.2 干扰GATA-1可抑制红系分化 与光学显微镜同一视野相比，荧光倒置显微镜显示，Down组大于90%的细胞呈绿色荧光，见图7。Western blot检测干扰后GATA-1的表达量，Down组显著低于NC-Down组（P＜0.05），见图 8。与NC-Down组相比，低氧下Down组γ-globin mRNA的表达水平在72 h显著降低（P＜0.05），见图9A。联苯胺染色结果也显示干扰GATA-1可显著降低联苯胺阳性率（P＜0.05），见图9B。流式细胞术结果显示，Down组在诱导72 h后细胞表面的CD235a表达水平显著低于NC-down组（P＜0.05），见图9C。细胞形态实验结果显示，与NCDown组相比，Down组在72 h时体积增大、核偏移和核缩小的细胞数目显著减少（P＜0.01），见图9D。

Figure 7.The fluorescence detection of GATA-1 knock-down lentivirus 96 h after infection（scale bar=50 μm）.A，B：NC-Down group；C，D：Down group.A，C：light microscopy；B，D：fluorescence microscopy.图7 GATA-1干扰慢病毒感染96 h后荧光检测

5 低氧条件下过表达或抑制GATA-1后miR-451a的表达检测

5.1 过表达GATA-1可促进miR-451a表达 RT-qPCR检测GATA-1过表达后miR-451a的表达，结果显示，低氧下诱导48 h后Up组miR-451a的表达量与NC-Up组相比无显著差异（P＞0.05），72 h时Up组miR-451a的表达量显著高于NC-Up组（P＜0.05），见图10。

5.2 干扰GATA-1可抑制miR-451a表达 RT-qPCR检测GATA-1抑制后miR-451a的表达，结果显示，低氧下诱导48 h后Down组miR-451a的表达量与NCDown组相比无显著差异（P＞0.05），72 h时Down组miR-451a的表达量显著降低（P＜0.05），见图11。

讨 论

Figure 8.The protein expression of GATA-1 in Down group and NC-Down group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCDown group.图8 干扰慢病毒感染后GATA-1蛋白表达的检测

GATA-1作为红系核心转录因子，主要通过靶向激活β-珠蛋白基因［12］、促红细胞生成素及其受体（erythropoietin/erythropoietin receptor，Epo/EpoR）［13］和microRNAs等的表达，促进红系分化。miR-451a的表达受GATA-1调控。在K562细胞红系分化模型中，GATA-1可激活miR-144/451基因簇上游区164 bp、570 bp和1 281 bp三个保守位点［14］，促进 miR-451表达。在人的17号染色体上，GATA-1可结合miR-144/451基因簇上游3.8 kb位点，激活RNA聚合酶Ⅱ对miR-451的转录［15］。利用基因芯片技术比较红系分化中miRNAs表达谱和GATA-1缺失的原红细胞系G1E在GATA-1恢复后miRNA的表达，显示miR-451a在正常红系分化过程中表达逐渐上调，且受到GATA-1的正向调控［16］，表明GATA-1正向调控miR-451具有促红系分化作用。鼠的胚胎干细胞过表达miR-451a后，其细胞内血红蛋白含量增高并伴有细胞表面 CD235a和TER-119 表达升高［5］，提示miR-451过表达能促进鼠胚胎干细胞向红系分化。miR-451在脐血来源的CD34+造血干祖细胞红系分化的早期阶段开始表达，持续到晚幼红阶段并处于高表达，其可作用于GATA-2的3′-非翻译区（3′-untranslated region，3′-UTR），下调GATA-2的表达继而促进红细胞成熟［17-18］。研究显示，低氧下GATA-1表达增高。利用质谱分析大鼠NRK-49F细胞在低氧下核蛋白表达变化时，显示GATA-1的表达显著增高［19］，提示GATA-1受低氧调控。低氧下肺泡II型细胞内GATA-1表达显著升高，诱导血红蛋白表达升高［20］。进一步研究证实，低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在低氧下可上调K562细胞和CD34+细胞内GATA-1的表达，促进红系分化［21］，满足细胞在低氧下的需氧要求。本实验结果也显示，低氧组K562细胞中GATA-1的表达随诱导时间延长显著增加并且在72 h其表达量显著高于常氧组。但miR-451a在低氧下是否影响红系分化鲜有报道。本研究结果显示，miR-451a的表达虽然在常氧组48 h和72 h无显著变化，但在低氧组其表达显著增加且表达量在72 h时显著高于常氧组，提示低氧能够诱导miR-451a表达促进红系分化。但GATA-1对miR-451a的调控关系在低氧下红系分化过程中的作用还不清楚。

Figure 9.GATA-1 knock-down inhibited erythroid differentiation of the K562 cells under hypoxia condition.A：the relative expression of γ-globin detected by RT-qPCR；B：the results of benzidine staining（scale bar=100 μm）；C：the expression of CD235a detected by flow cytometry；D：the results of Wright-Giemsa staining（scale bar=10 μm）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NC-Down group.图9 低氧下干扰GATA-1后抑制红系分化

Figure 10.GATA-1 over-expression increased the expression of miR-451a under hypoxia.The expression of miR-451a was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Up group.图10 低氧下过表达GATA-1可促进miR-451a表达

Figure 11.GATA-1 knock-down decreased the expression of miR-451a under hypoxia.The expression of miR-451a was detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC-Down group.图11 低氧下干扰GATA-1可抑制miR-451a表达

依据文献报道，本课题组复制低氧下K562细胞红系分化模型。γ-globin和CD235a的表达均表现为随诱导时间延长显著增加，表明低氧K562细胞红系分化模型复制成功。低氧组γ-globin的mRNA表达显著高于常氧组，这一结果与Kaneko等［22］研究结果相符合。利用联苯胺染色法检测血红蛋白的表达可用来评价红系分化程度［23］。联苯胺染色结果显示低氧组细胞阳性率显著高于常氧组，与γ-globin结果相一致，说明低氧有助于γ-globin表达。GATA-1与miR-451a间的相关性分析表明，低氧组GATA-1与miR-451a呈现正相关关系，提示低氧下GATA-1与miR-451a之间的正相关性与K562细胞红系分化有关。采用慢病毒感染实验验证其相关性。低氧下GATA-1过表达能够增强红系分化指标的表达，同时瑞氏-吉姆萨染色作为分析红细胞典型特征变化的方法［24］，其结果显示Up组体积增大、核偏移和核缩小的细胞数目比NC-Up组显著增多，提示低氧下GATA-1过表达有利于K562细胞红系分化。低氧下干扰GATA-1表达可减弱红系分化指标的表达，同时瑞氏-吉姆萨染色显示Down组体积增大、核偏移和核缩小的细胞数目显著减少，提示低氧下干扰GATA-1表达能抑制红系分化。低氧下过表达GATA-1后miR-451a在72 h显著高于对照组，而干扰GATA-1后miR-451a在72 h显著低于对照组，提示低氧下GATA-1可正向调控miR-451a的表达。

综上所述，本研究通过K562细胞红系分化模型，分析低氧下GATA-1与miR-451a的表达情况和相关关系，提示低氧可诱导GATA-1表达增高，进而加强miR-451a的表达，这种正相关关系参与低氧促红系分化过程。