IOX1对TGF-β诱导的LX2细胞增殖、凋亡及细胞外基质相关蛋白表达的影响*

田 甜，余 蕾，谢汝佳，韩 冰，丁凯泽，杨 勤△，杨 雪

（1贵阳市妇幼保健院优生遗传科，2贵州医科大学病理生理学教研室，3贵阳市妇幼保健院病理科，4贵阳市妇幼保健院生殖中心，贵州贵阳550004）

组蛋白赖氨酸（lysine，K）甲基化是一种表观遗传修饰方式，与组蛋白乙酰化修饰不同，它并不影响组蛋白尾上赖氨酸的电荷数，但会造成空间位阻，导致赖氨酸的疏水性变化，形成新的蛋白质结合位点，从而广泛参与基因的转录调控［1］。组蛋白H3赖氨酸残基上能够发生甲基化修饰的位点有很多，比如H3K4、H3K9、H3K27等；这些组蛋白甲基化修饰对基因表达的影响不尽相同，例如H3K4二甲基化（H3K4 dimethylation，H3K4me2）具有促进基因转录起始的作用，而H3K9二甲基化（H3K9 dimethylation，H3K9me2）具有抑制基因转录起始的作用［2］。

通过抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖、活化以及调节细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成和代谢之间的平衡逆转肝纤维化的发生发展，一直是抗肝纤维化治疗的研究热点［3］。有文献报道，靶向改变HSC中异常的组蛋白甲基化状态，能够抑制HSC的增殖和活化，从而抑制肝纤维化的发生发展。Yang等［4］发现组蛋白H3K27甲基转移酶抑制剂DZNep通过降低HSC-T6细胞中Dickkopf1（DKK1）基因启动子区H3K27的甲基化水平，导致DKK1蛋白表达上调。DKK1是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，其蛋白表达上调会阻断Wnt/βcatenin信号通路，抑制HSC的增殖和活化。上述研究提示组蛋白H3K27甲基转移酶抑制剂DZNep通过改变HSC中异常修饰的H3K27甲基化，表现出抗肝纤维化作用，表明利用抑制剂或siRNA靶向改变激活型HSC中异常的组蛋白甲基化状态可以抑制HSC的增殖和活化。本课题组前期研究发现，在HSC活化过程中H3K9甲基化水平降低［5］，但是关于采用组蛋白H3K9去甲基化酶抑制剂改变激活型HSC中H3K9甲基化修饰对HSC增殖、活化以及ECM合成和代谢影响的研究，目前尚未见相关报道。

IOX1（5-羧基-8-羟基喹啉，5-carboxy-8-hydroxyquinoline）是新发现的一种以8-羟基喹啉为基础的强效组蛋白去甲基化酶抑制剂，它能够与组蛋白H3K9去甲基化酶活性中心的Fe（II）螯合，使去甲基化过程中单电子传递障碍，甲基不能发生羟基化，从而导致细胞中H3K9甲基化水平增加［6］。但目前应用IOX1防治疾病的研究，鲜有报道。有研究采用IOX1刺激血管紧张素Ⅱ预处理的血管平滑肌细胞，发现细胞周期蛋白D1基因启动子区H3K9甲基化富集量增加，细胞周期蛋白D1的表达被抑制，由于细胞周期蛋白D1与细胞增殖有关，其表达下降可导致细胞周期停滞在G0/G1期，因此研究者认为IOX1可通过抑制细胞周期蛋白D1的表达而抑制血管平滑肌细胞增殖，具有抗动脉粥样硬化的作用［7］。组蛋白H3K9去甲基化酶抑制剂可上调激活型HSC细胞中H3K9me2水平，但是否能够抑制HSC的增殖和活化，减少ECM沉积呢？相关的研究目前尚未见报道。鉴于此，本研究拟通过IOX1处理转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）诱导活化的人HSC细胞株LX2，观察IOX1调控H3K9me2修饰对LX2细胞增殖、凋亡以及ECM相关蛋白［α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原（collagen type I，Col I）、基质金属蛋白酶 1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制物 1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）］表达的影响。

材料和方法

1 材料

人肝星状细胞株LX2购自上海细胞库。IOX1和DMSO购自Sigma；DMEM培养基和胎牛血清（Gibco）；胰酶和彩虹Marker（北京索莱宝科技有限公司）；细胞裂解液、蛋白酶抑制剂和BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物科技有限公司）；annexin VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术有限公司）；抗β-actin抗体、抗组蛋白H3抗体、山羊抗兔IgG+H以及兔抗H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1抗体购自Abcam。

2 主要方法

2.1 LX2细胞活化 本实验所用LX2细胞均经过5 μg/L TGF-β诱导而活化，在此基础上加入不同浓度的IOX1处理。

2.2 细胞增殖实验 采用实时无标记细胞分析技术（real-time cellular analysis，RTCA）检测不同浓度IOX1对LX2细胞增殖的影响。RTCA系统通过EPlate底部的电极检测贴壁细胞的电阻抗，可反映细胞的数量、活力、形态以及贴壁情况，以细胞指数（cell index，CI）作为检测指标。取对数生长期的细胞制成细胞悬液并进行细胞计数，以每孔5×103个的密度接种于EPlate，10 h后分别加入终浓度为50、100、200和400 μmol/L的IOX1处理细胞，对照组不予处理，每个浓度设置3个复孔。连续动态监测72 h，观察不同浓度IOX1对LX2细胞增殖的影响，每15 min记录1次。经过RTCA软件分析得出CI值。根据RTCA实验结果确定后续实验中IOX1的给药浓度。

2.3 倒置显微镜观察LX2细胞形态学的变化 取对数生长期的活化LX2细胞，细胞融合度达80%左右时，将细胞随机分为对照组（control组，不予IOX1处理）、50 μmol/L IOX1组、100 μmol/L IOX1组及300 μmol/L IOX1组（IOX1给药浓度由RTCA实验结果确定）。观察不同浓度IOX1处理IOX1细胞24 h后的细胞形态学变化。

2.4 流式细胞术检测LX2细胞凋亡情况 取对数生长期的活化LX2细胞，制成细胞悬液并进行细胞计数，在每个无包被的塑料皿（10 cm）中铺1×106个细胞，置于CO2培养箱中培养24 h后，将细胞随机分为对照组（不予IOX1处理）、50 μmol/L IOX1组、100 μmol/L IOX1组及 300 μmol/L IOX1组。给药24 h后用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，制备密度为1×108/L的细胞悬液，取1 mL离心，除去上清液，加入annexin V-FITC结合液195 μL重悬，再先后加入annexin V-FITC 5 μL和PI染色液10 μL，在室温下避光孵育20 min后置于冰浴中，流式细胞仪检测。

2.5 Western blot检测LX2细胞中组蛋白H3K9me2水平以及 α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平 收集各组细胞，分别加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min，收集细胞悬液，超声破碎，12 000 r/min、4℃离心20 min，弃沉淀，收集上清，使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，取40 μg总蛋白上样，行SDSPAGE，电泳结束后转移蛋白至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭90 min，分别加入1∶1 500稀释的兔抗α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1抗体，以及1∶5 000稀释的兔抗H3K9me2抗体，4℃摇床孵育过夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（1∶4 000），室温孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL发光成像，分别以β-actin和组蛋白H3为内参照。用Image Lab图像分析软件对每个条带灰度值进行定量分析。

3 统计学处理

用SPSS 20.0统计软件进行分析，数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法）。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 细胞增殖结果

任意接种密度下的LX2细胞在接种5 h内，CI会快速达到最大值，到10 h时CI又降低，随后细胞进入对数生长期，因此后续实验选择在细胞接种10 h后再加入不同浓度IOX1处理。细胞接种密度在每孔2×104和1×104个细胞时，CI分别在20和40 h时就已达到最大，并在此之后逐渐下降；而在每孔5×103个细胞接种密度下，CI在60 h时仍处于生长旺盛期，见图1A。因此，我们确定以每孔5×103个细胞的接种密度进行后续的细胞增殖实验。

接种LX2细胞10 h后，分别加入不同浓度的IOX1，持续检测72 h。RTCA结果显示，和对照组相比，不同浓度IOX1对LX2细胞增殖的影响表现为先促进后抑制，且IOX1浓度越大，抑制细胞增殖的作用越明显，见图1B。

根据LX2细胞的增殖曲线，我们得到IOX1处理LX2细胞24 h所对应的IC50曲线（图1C），算得IOX1处理24 h的IC50为150 μmol/L。因此我们选取50、100和300 μmol/L IOX1进行后续实验。

2 倒置显微镜观察不同浓度IOX1处理的LX2细胞的形态学变化

和对照组相比，50 μmol/L IOX1处理LX2细胞24 h后细胞形态没有明显变化；在100 μmol/L IOX1组和300 μmol/L IOX1组中可见细胞开始皱缩，胞膜不完整，部分细胞甚至出现坏死现象，见图2。

3 不同浓度IOX1处理的LX2细胞的凋亡情况

流式细胞术检测不同浓度IOX1处理24 h后LX2细胞的凋亡情况，结果显示，与对照组相比，50和100 μmol/L IOX1对LX2细胞凋亡无明显影响（P＞0.05），而300 μmol/L组细胞凋亡率较对照组明显增加（P＜0.05），见图3。

4 IOX1处理LX2细胞后H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平

与对照组相比，50、100和300 μmol/L IOX1组中H3K9me2水平明显提高，表现出浓度依赖性（P＜0.05）；与对照组相比，50和100 μmol/L IOX1组中α-SMA和TIMP-1的表达没有明显差异（P＞0.05），但在300 μmol/L IOX1组α-SMA和TIMP-1蛋白表达量较对照组明显降低（P＜0.05）；与对照组和50 μmol/L IOX1组相比，Col I蛋白在100和300 μmol/L IOX1组中表达明显降低（P＜0.05）；与对照组相比，50、100和300 μmol/L IOX1组中MMP-1蛋白表达明显增加（P＜0.05），且呈剂量依赖性特点，见图4。

讨 论

HSC位于肝细胞和肝窦内皮细胞之间的Disse腔隙中，其在生理状态下的主要功能是储存和代谢维生素A，因而又称储脂细胞。病理状态下，HSC的形态和功能均发生改变，HSC失去脂质表型并开始合成ECM，ECM的合成增多而降解又相对不足，造成ECM的大量沉积，这一过程被称为HSC的活化，因此，HSC的活化被认为是肝纤维化发生发展的关键环节［8］。TGF-β是目前已知最强的促肝纤维化发生的细胞因子，它通过TGF-β/Smad信号通路激活HSC，使HSC中ECM合成增加并改变ECM代谢，从而促进肝纤维化的发生发展［9］。在本研究中，我们采用活化的人HSC细胞株LX2作为研究对象，为保证LX2活化的均衡性，我们用TGF-β刺激LX2细胞活化，在此基础上采用IOX1干预TGF-β预处理活化的LX2细胞，观察IOX1对LX2细胞H3K9甲基化修饰的改变及对细胞活化和ECM代谢的影响。

Figure 3.Apoptosis of LX2 cells treated with IOX1 at different concentrations.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；&P＜0.05 vs 50 μmol/L IOX1 group；#P＜0.05 vs 100 μmol/L IOX1 group.图3 不同浓度IOX1处理的LX2细胞的凋亡情况

Figure 4.The protein levels of H3K9me2，α-SMA，Col I，MMP-1 and TIMP-1 in the LX2 cells exposed to IOX1 at different concentrations.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；&P＜0.05 vs 50 μmol/L IOX1 group；#P＜0.05 vs 100 μmol/L IOX1 group.图4 IOX1处理的LX2细胞中H3K9me2、α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1蛋白水平的变化

RTCA和流式细胞术结果显示，IOX1一方面能够抑制LX2细胞增殖，另一方面明显促进LX2细胞凋亡。已有大量研究证实，减少活化的HSC，或者促进活化的HSC细胞发生凋亡能够有效抑制肝纤维化的发生发展。越来越多研究发现，促HSC凋亡的药物具有抗肝纤维化作用。因此，我们推测IOX1可能通过抑制HSC增殖、促进HSC凋亡而发挥抗肝纤维化作用。

IOX1作为一种组蛋白去甲基化酶抑制剂，能够上调细胞中H3K9甲基化水平。本研究发现IOX1可显著提高TGF-β诱导的LX2细胞中H3K9me2水平，且呈剂量依赖性。α-SMA的表达被看作HSC活化的标志物，且活化的HSC表达大量以Col I为主的ECM［10-11］，故抑制HSC活化和减少ECM合成被认为是治疗肝纤维化的有效策略。本研究中Western blot结果显示，IOX1可抑制α-SMA和Col I蛋白表达。通常，H3K9me2水平提高会抑制基因的表达。因此，我们推测IOX1可能通过上调编码α-SMA和Col I蛋白的基因启动子区H3K9me2水平而抑制α-SMA和Col I蛋白表达。此外，HSC活化过程中ECM合成增加并不是ECM沉积的全部因素，ECM降解减少在肝纤维化发生发展中起了更为关键的作用。MMP-1能够降解以胶原为主的ECM，其活性又受到TIMP-1的抑制［12-13］。本研究中Western blot结果显示，IOX1能够促进细胞中MMP-1蛋白表达，抑制TIMP-1蛋白表达。这表明IOX1可纠正MMP-1和TIMP-1之间的失衡，促进ECM的降解，有效抑制肝纤维化的发生发展。但是IOX1是否通过H3K9me2调控MMP-1和TIMP-1的表达，还需进一步研究。

综上所述，组蛋白去甲基化酶抑制剂IOX1能够抑制HSC增殖，促进HSC凋亡，减少ECM合成，促进ECM降解。IOX1可能通过H3K9me2调控α-SMA、Col I、MMP-1和TIMP-1的表达，从而发挥抗肝纤维化的作用。