佛山地区无精子症及严重少精子症患者Y 染色体微缺失基因分析

吴智刚 李炜煊 李启欣 李小蓝

不育是现有卫生疾病中较为常见的一种类型,严重影响到世界各国的人口增长。遗传因素导致男性不育中Y 染色体微缺失占据主要地位［1,2］。其中,位于Y 染色体长臂远侧端的无精子因子(Azoospermia factors,AZF)区域出现缺失是遗传学导致男子生精障碍的主要因素。但现阶段对Y 染色体AZF 区域基因微缺失情况,仍未获得相对明确的数据［3］。本研究中选取严重少精子症、无精子症患者作为研究对象,并选取50 例精液参数正常的男性作为对照进行研究,旨在分析Y 染色体长臂微缺失对严重性少精子症以及无精子症男性不育患者的影响以及相关性,为临床男性生精障碍不育患者的治疗奠定医学基础,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年1～9 月本院泌尿科门诊接治的300 例原发性男性不育患者作为研究对象,按照疾病分型不同分为严重少精子症组(200 例)及无精子症组(100 例),同时选取50 例可正常产生精子的男性作为正常组。本研究已通过本院医学伦理委员会审核准许。所有研究对象均签署知情同意书。纳入标准：经临床诊断及精液检查后确诊为严重少精子症或无精子症者；无精神障碍,具备良好的沟通能力。

1.2 方法

1.2.1 血液样本采集 所有研究对象均提取2 份5 ml骨髓或者外周血,利用肝素进行抗凝全血后,分别用于核型分析以及全血DNA 提取［4］。

1.2.2 染色体核型 取一份血液样本加入5 ml 含小牛血清的培养液,充分混匀后置于37℃条件下的培养箱中进行孵育,持续3 d 后按照常规操作进行染色体标本制备,进行G 显带,在油镜下对100 个淋巴细胞进行分析。

1.2.3 外周血基因组DNA 提取 根据Axygen biosciences 公司提供的方法步骤将另一份血液标本进行外周血粒细胞基因组DNA 提取。

1.2.4 Y 染色体微缺失检测 选取位于Y 染色体长臂AZFa 区、AZFb 区、AZFc 区、AZFd 区各两个位点进行检测,各区域的位点依次为sY86、sY84、sY127、sY134、sY254、sY255、SY152、SY153,采用多重聚合酶链反应结合Taqman 技术,检测研究对象DNA 中AZF 微缺失,同时以锌指蛋白基因(ZFX/ZFY,SY238)和睾丸决定因子(SRY)作为内参照。

1.2.5 PCR 扩增及检测 外周血基因组DNA 模板采用梯度聚合酶链式反应(PCR)仪进行PCR 扩增反应,采用2%琼脂糖凝胶对扩增产物进行水平电泳,应用凝胶成像分析系统对PCR 产物进行分析。

1.2.6 精液质量检测 所有研究对象需进行精液检测,禁欲3～7 d 到院检查,手淫取精2～6 ml,7 d 后复查,取两次平均值［5］。

1.3 观察指标 比较三组的Y 染色体长臂区微缺失情况、正常组与严重少精子症组的精子密度和精子活力(a 级精子、a+b 级精子)。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组Y 染色体长臂区微缺失情况对比 严重少精子症组、无精子症组AZF 区缺失率分别为11.50%、22.00%,均明显高于正常组的4.00%,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 正常组与严重少精子症组的精子密度和精子活力对比 正常组的精子密度(32.72±14.37)×106/ml 高于严重少精子症组的(15.06±13.27)×106/ml,精子活力中a 级、a+b 级精子分别为(24.87±6.51)%、(41.38±11.04)%均高于严重少精子症组的(12.48±6.86)%、(29.56±14.96)%,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表1 三组Y 染色体长臂区微缺失情况对比［n(%)］

表2 正常组与严重少精子症组的精子密度和精子活力对比()

表2 正常组与严重少精子症组的精子密度和精子活力对比()

注：与正常组对比,aP＜0.05

3 讨论

世界卫生组织进行一项关于不孕不育夫妇不孕原因的调查,结果显示近15%的不孕不育夫妇中近一半是因男性原因导致［6］。而引发男性不育症的主要原因中接近1/3 是因先天性遗传异常导致精子生成障碍,进而引发不孕不育。AZF 区域的基因缺失情况存在一定差异,AZF 区域中的任何基因出现微缺失均可造成男子生精障碍的疾病问题。

李翠等［7］研究指出当男性患者出现AZFa 区缺失时,其临床表现主要为支持细胞综合征,若缺失基因位于AZFb 区域,则会表现为精子生成障碍,患者的精子在精母细胞阶段停止发育,最为常见的缺失类型为AZFc 缺失,相应诱发的临床症状为少精子症。亐开兴等［8］研究指出患有唯支持细胞综合征的患者,在出现无精子症状的同时会出现AZFb、AZFc 区域部分缺失以及AZFa 区完全缺失的情况,若存在以上情况即使采用经皮穿刺附睾抽吸取精术、睾丸精子穿刺获取精子的几率也非常小［9］。本项研究采用多重PCR 技术对200 例严重少精子症患者、100 例无精子症患者、50 例无生精障碍的男性进行研究对比,分析其Y 染色体长臂AZFa、AZFb、AZFc 及AZFd 区的缺失情况,结果显示严重少精子症组、无精子症组AZF 区缺失率分别为11.50%、22.00%,均明显高于正常组的4.00%,差异均有统计学意义(P＜0.05)。与以上结论相符。本研究中,正常组的精子密度高于严重少精子症组,精子活力中a 级、a+b 级精子均高于严重少精子症组,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。证实AZF 区域确实影响男子的精子生成,进而降低男性的精液质量,引发不育。包毅刚等［10］研究后得出一致结论。

综上所述,及时到院检测Y 染色体长臂AZF 区微缺失情况可从基因角度明确生精障碍原因,有利于相应治疗措施的制定,减少医疗支出,有效避免药物、手术治疗对身体造成的损伤,缓解子代遗传缺陷负荷,为优生优育提供可靠的依据,值得临床推广。