施用生物有机肥对烟草根际土壤微生物区系的影响

张明宇， 刘高峰， 李小龙， 舒勤静， 田艳华， 石德兴， 王岩

(1.郑州大学化工与能源学院，河南 郑州 450001；2.南平市烟草公司邵武分公司，福建 邵武 354000)

烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种分布广泛、具有严重危害的细菌性土传病害[1]，在中国分布也较为广泛，河南、云南、湖南、广西、广东、福建等主要产区均有发生[2]。烟草青枯病的发生、流行和危害是诸多因素综合作用的结果。以往对烟草青枯病的研究和防控主要集中在抗性品种选育、化学药剂防控及改善栽培管理等方面[3-5]。虽然各种防控措施均能起到一定效果，但这些防控措施也存在着选育周期长、化学药剂造成环境污染、轮作受土地资源限制等诸多问题[6]。近年来，人们逐渐重视起通过调控土壤微生物实现生物防控土传病害的方法，其主要措施是通过施用拮抗菌、有机肥或生物有机肥等调节土壤微生态、改善土壤微生物多样性、抑制病原菌的生长或提高植物自身抗性，从而抑制土传病害的发生[7-8]。分子生物技术快速发展和应用也为研究微生物群落结构特征提供了广阔的空间[9]。第2代高通量测序技术能够将实验室不可培养的微生物通过16 S/18 S rDNA基因测序的方法检测出来，对分析微生物群落组成结构和多样性展现出巨大的优势，已成为研究土壤微生物的重要工具[10-11]。本试验将生物有机肥施用于烟田以防控烟草青枯病，在检验生物有机肥对烟草青枯病的防控效果的同时，探讨烟草根际土壤微生物数量和微生物区系结构的变化与青枯病发生间的关系，为生物防控烟草青枯病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验地点位于福建省邵武市沿山镇烟草基地。邵武属于中亚热带季风气候区，日照充足，常年平均降雨量1 800 mm，年平均气温18 ℃，试验地点海拔200～250 m。试验期间平均气温28.5 ℃。

1.2 试验材料

供试烤烟品种为K 32，供试烟田前茬作物为水稻。供试烟田在移栽前以条沟方式施用牛粪1 500 kg·hm-2，钙镁磷肥450 kg·hm-2，移栽时施烟叶专用肥375 kg·hm-2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)= 12.5∶8∶22.5，团棵期追施硝酸钾375 kg·hm-2，旺长期硫酸钾270 kg·hm-2。烟田土壤类型为沙质壤土，土壤pH值为5.2，有机质含量为23.7 g·kg-1,碱解氮含量为127.5 mg·kg-1，速效钾含量为198.1 mg·kg-1，有效磷含量为213.7 mg·kg-1。

1.3 试验处理

试验共分为2个处理，每个处理小区面积为666.7 m2。处理1(T1)为空白处理，按照当地常规施肥与管理，即只施烟叶专用肥、化肥、有机肥；处理2(T2)施用生物菌剂(生物菌剂含活菌数≥109·g-1)45 kg·hm-2(在与对照相同用量的有机肥中加入拮抗菌复合菌剂，拮抗菌选用解淀粉芽孢杆菌B 1619)。

试验中土壤样品编号意义如2Y-1-1中，第1个数字“1”代表第1次取样；第2个数字“1”代表处理1；第3个数字“1”代表重复1，其他土壤编号与此意义相同(移栽前样品为平行样，不区分处理与对照)。分别在烟株移栽前、团棵期、旺长期和采摘期采取根际土壤进行可培养微生物数量测定和16 S rDNA/18 S rDNA基因测序，以及其他理化性状分析。

1.4 测定内容及方法

1.4.1 土样采集 分别在烟株移栽前、团棵期(移栽后40 d)、旺长期(移栽后70 d)和采收期(移栽后100 d)，采用S型5点取样法采取烟株根际土壤。取样时首先去除烟株根部表层土壤，以烟株茎部为中心直径10 cm左右、深10 cm左右处的土壤进行取样。取样后用密封袋低温封存，部分送往实验室在4 ℃下冷藏以待微生物数量测定，部分用15 mL离心管装满在低温保存条件下送往上海美吉生物医药科技有限公司对微生物进行基因测序。

1.4.2 微生物数量测定 土壤微生物数量采用涂布平板法测定，细菌、真菌、放线菌数量分别采用肉膏蛋白胨培养基、孟加拉红培养基、高氏1号培养基进行测定。为了更准确地比较土壤微生物数量，在计算时去除土壤中的水分，以干土表示。

1.4.3 病情测定 为了评估生物有机肥在烟株整个生长期内对烟草青枯病的防治效果，在烟株移栽后每隔10 d记载发病情况，统计病情，计算青枯病的发病率、病情指数和防控率。青枯病病情指数的分级调查按照GB/T 23222—2008烟草病虫害分级及调查方法进行。

发病率 =(发病株数/总株数)×100%；

病情指数 =(∑各级病株数或叶数×该病级值)/调查总株数或叶数×最高级值)×100；

防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100%

1.4.4 产量统计 烟叶采收烘烤按各处理分别进行。按照GB 2635—1992烤烟对各处理进行烟叶分级，并按照“国家发展改革委国家烟草专卖局关于2014年烟叶收购价格政策的通知”中的“2014年烤烟价区表”和“2014年烤烟收购价格表”计算各处理的中上等烟比例和均价等生产质量指标。

1.4.5 微生物基因测序 土壤微生物基因测序采用第2代高通量测序技术，对烟株不同生育时期的土壤样本进行细菌(16 S rDNA)和真菌(18 S rDNA)序列检测。DNA 抽提和PCR扩增、 Illumina Miseq 测序、数据处理等方法参见陈乾锦等[12]的方法。

1.4.6 微生物Alpha多样性常用指数算法 环境中微生物的多样性(Alpha)分析可以反映微生物群落的丰度和多样性变化。常用的指标有Sobs 指数、Shannon指数、Chao指数等，其计算公式参见孙慧等[13]的方法。

1.5 数据计算与统计分析

微生物数量采用Excel 2010进行数据处理，显著性分析采用SPSS Statistics 20.0。测序数据在上海美吉生物医药科技有限公司提供的I-Sanger生物信息分析云平台进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 生物有机肥对土壤微生物数量的影响

如表1所示，土壤中细菌数量在移栽前和团棵期为106cfu·g-1，在旺长期数量提升一个数量级达到107cfu·g-1；放线菌数量维持在105cfu·g-1左右；真菌数量在104cfu·g-1。在烟株生长发育各个时期，微生物数量为细菌>放线菌>真菌，而且基本上相差1个数量级。

土壤中可培养细菌数量在移栽前、团棵期、成熟期为106cfu·g-1，而旺长期则超过了107cfu·g-1。从整体上来看，细菌数量随着烟株生长而增长，在旺长期达到最高，到成熟期后又有所回落。在团棵期处理组显著高于对照组，表明施用生物有机肥后细菌可以很好地在根际定殖，但进入旺长期后对照组中细菌数量反而明显高于处理。这表明随着烟株的生长根际微生物区系发生了改变。进入成熟期后处理组与对照组间土壤微生物在数量上的差异已不明显。

土壤中可培养放线菌数量基本都在105cfu·g-1以内，从整体上来看放线菌数量同样呈现出随着烟株生长而随之增长，在旺长期达到最多，进入成熟期后略有减少的趋势。从对照组与处理对比可以看出，进入团棵期后处理组中放线菌数量明显低于对照组，表明施用生物有机肥后放线菌在烟株根际土壤中的定殖并不理想。进入旺长期后处理组与对照组之间差异不显著，但进入成熟期后处理组中的放线菌数量进一步增多并显著高于对照组。

表1 生物有机肥对土壤微生物数量的影响Table 1 Effects of bio-organic fertilizer on soil microorganism quantity

注：不同小写字母表示同种微生物同一处理不同时期的差异显著性(P<0.05)；不同大写字母表示同种微生物同一时期不同处理间差异显著性(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference between the same microorganism at different stages in the same treatment (P<0.05)；Different capital letters indicate significant difference between different treatments of the same microorganism at the same stage (P<0.05).

土壤中可培养真菌数量基本都在104cfu·g-1以内，真菌数量在移栽前较低，进入团棵期明显增加，在旺长期与成熟期达到最多。处理组与对照组相比，在各个时期处理组中真菌数目都略高于对照组。

由此可见，施用生物有机肥对土壤中细菌的影响最大，其次为放线菌，对真菌的影响最小。

2.2 生物有机肥对烟叶产量与品质的影响

如表2所示，处理组无论是在产量、均价、中上等烟比例上均明显高于对照组。表明施用生物有机肥在改变烟株根际微生物区系的同时也能实现增产和增值的效果。

表2 生物有机肥对烟叶产量与品质的影响Table 2 Effects of bio-organic fertilizer on yield and quality of tobacco leaf

注：同列不同小写字母表示不同处理差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between different treatments (P<0.05).

2.3 生物有机肥对烟草青枯病的田间防控效果

如表3所示，T1处理的发病率为76.2%，施用生物有机肥后青枯病的发病率显著降低，在T2中发病率分别为47.6%，其防控效果为38.2%。表明施用生物有机肥能对烟草青枯病有较好的防控效果。

表3 生物有机肥对烟草青枯病的田间防控效果Table 3 Prevention and control effects of bio-logical organic fertilizer on tobacco bacterial wilt in field

注：同列不同小写字母表示不同处理差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between different treatments (P<0.05).

2.4 生物有机肥对土壤微生物区系的影响

2.4.1 生物有机肥对土壤细菌群落组成的影响 如图1所示，在门水平上共列出12种在样本中占比大于1%的物种。如果将相对丰度大于10%的细菌划分为优势类群[14]，则样本中共有5种优势物种，其相对丰度占样本总量的80%以上。在烟株各生长时期土壤优势类群总相对丰度均在对照组与处理组中表现出差别。其中，在团棵期与旺长期其相对丰度均为处理组低于对照组，而进入成熟期后处理组反而高于对照组，表明旺长期是烟株根际土壤微生物区系发生明显改变的时期。

对优势类群在各个时期进行分析的结果表明，移栽前3个样本均未施用处理，各平行样本菌落结构无明显差异；在团棵期变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)在对照组中的相对丰度分别为30.14%,21.82%，在处理组中的相对丰度分别为23.47%,17.84%(其差异均达到1%的显著水平)；绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)在对照组中的相对丰度分别为13.69%，5.33%，在处理组中的相对丰度分别为20.11%，6.96%(其差异均达到1%的显著水平)。进入旺长期后变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度在对照组中分别为38.68%,19.80%，处理组中分别为26.25%，10.16%(其差异达到1%的显著水平)；处理组中绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度在对照组中分别为8.62%,3.85%，处理组中分别为19.29%,8.48%(其差异达到1%的显著水平)。进入成熟期，其菌落结构的规律与团棵期、旺长期相比普遍发生反转。其中处理组中变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度反而多于对照组，其在对照组、处理组中相对丰度分别为22.73%,24.60%(其差异达到1%的显著水平)。酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度相比对照组反而显著减少，其在对照组、处理组中的相对丰度分别为8.24%,5.56%(其差异达到1%的显著水平)。

对于非优势菌种来说，拟杆菌门(Bacteroidetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)在团棵期与旺长期均表现为处理组显著低于对照组，进入成熟期后表现为处理组显著高于对照组。浮霉菌门(Planctomycetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)在团棵期与旺长期表现为处理组显著高于对照组，进入旺长期之后表现为处理组显著低于对照组(其差异均达到5%的显著水平)。

图1 烟田土壤中细菌在门水平上的群落组成

2.4.2 生物有机肥对真菌群落组成的影响 如图2所示，在真菌门水平上共列出7种在样本中占比大于1%的物种。其中，子囊菌门 (Ascomycota)、担子菌门 (Basidiomycota)、Norank_k_Fungi为优势物种，占样本总量的95%以上。这3类都是成熟期在处理组与对照组中表现出差异，其中子囊菌门 (Ascomycota)表现为处理组显著低于对照组(其差异达到1%的显著水平)；担子菌门 (Basidiomycota)在烟草生长期内表现为先减少后增加，成熟期处理组明显高于对照组；norank_k_Fungi在烟草生长期内表现为持续增长趋势，在成熟期处理组中的相对丰度显著低于对照组(其差异达到1%的显著水平)。其他非优势物种均在成熟期表现出处理组相对丰度高于对照组的情况，旺长期与成熟期褐藻门 (Ochrophyta)在处理组中相对丰度显著高于对照组(其差异均达到1%的显著水平)。

图2 烟草土壤中门水平下真菌的群落组成

2.4.3 生物有机肥对烟株根际土壤微生物Alpha多样性的影响 细菌Alpha多样性如表4所示，Coverage指数是指各样本文库的覆盖率，其数值越高则样本中序列被测出的概率越高。本试验中各样本细菌的Coverage值都在94%以上，表明本次测序结果能够代表样本中微生物的真实情况。Sobs(the observed richness)值表示丰富度实际观测值，即OTU数目，其在移栽前与团棵期各处理之间差别不明显，在旺长期表现出差异，在对照组、处理组中分别为2 394，2 813(其差异达到5%的显著水平)，表明在处理组中的物种数目明显多于对照组。Shannon指数能反映群落多样性，其指数值越大说明群落多样性越高，其在对照组、处理组中分别为6.37，6.80(其差异达到1%的显著水平)，表明处理组中的生物多样性更高。Chao指数反映群落丰富度(Community richness)，指数越大群落丰富度越高，其在旺长期表现为处理组高于对照组，表明处理组的菌群丰度更高。

真菌Alpha多样性如表5所示，Sobs指数在移栽前与团棵期的处理和对照组之间未表现出差别，进入旺长期后在对照组、处理组中分别为192，222(其差异达到1%的显著水平)，而在成熟期其差异表现得更为显著，表明施用生物有机肥能显著增加根际土壤中的物种数目。Shannon指数在旺长期表现出差别，在对照组、处理组中分别为2.54，2.99(其差异达到1%的显著水平)，进入成熟期差别更加显著，表明处理组中的物种多样性更高。Chao指数同样是在旺长期与成熟期表现出差别，其规律与Shannon指数相似，表明处理组中的菌群丰度更高。

表4 烟田土壤中细菌微生物的Alpha多样性

表5 烟田土壤中真菌微生物的Alpha多样性Table 5 Alpha diversity of fungi in tobacco fields

2.4.4 生物有机肥对烟株根际土壤微生物Beta多样性的影响 为准确表述不同样本的相似性和差异关系，对样本距离矩阵进行聚类分析，构建样本层级聚类树。分别将烟田土壤样本中的细菌和真菌进行层级聚类分析，通过样本的层级聚类分析可以看出，细菌(图3-a)随着烟株的生长根际微生物区系不断发生变化，移栽前与成熟期的样本可以完全聚类在一起，且相隔较远，表明根际微生物区系在朝着一定的方向发生变化。团棵期对照组样本相隔较近并开始与处理组分开，进入旺长期后对照组与处理组的差异更加显著，表明添加生物有机肥显著改变了烟株根际微生物区系结构。真菌(图3-b)移栽前样本间差距较小，进入团棵期，处理与对照组之间距离较近，未表现出明显差别，在旺长期与成熟期处理与对照组之间差异较大，2个时期的对照样本之间差异较小。

2.4.5 生物有机肥对烟株根际土壤微生物区系及物种差异的影响 为了找出处理组与对照组之间的差异物种，将对照组与处理组在4个时期微生物的群落相对丰度数据分别整合成T1组、T2组，运用统计学方法检测不同组(样本)微生物群落中表现出的丰富度差异的物种，进行假设性检验，评估观察到差异的显著性，从而得到具有显著差异的物种。如图4所示。细菌在属水平上共列出相对丰度排名前10的物种，分析发现微球菌科(Micrococcaceae)下的属差异性较为明显，该菌在土壤中的相对丰度如图4-a所示。链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)虽然在总丰度上为处理组略高对照组，但通过物种组成分析发现其在成熟期表现为处理组明显高于对照组。除此之外，等球菌属(Isosphaera)、罗河杆菌属(Rhodanobacter)也表现为处理组高于对照组。

注：树枝长度代表样本间的距离，土壤样本后边的数字代表平行样。a.细菌物种;b.真菌物种。Note: The length of branches represents the distance between samples, and the number behind soil samples represents parallel samples.

a.Species of bacterial； b.Species of fungi.

图3 烟田土壤微生物在OTU水平上的层级聚类分析

Fig.3 Hierarchical cluster analysis of soil microorganism on OTU level in tobacco fields

注：横坐标表示属分类水平下的物种名，纵坐标表示该样本的某一物种丰度的百分数数值，不同颜色表示不同分组。最右边为P值，*表示0.01

Note: The abscissa represents the species names at the genus classification level, the ordinate represents the percentage of a species abundance value in the sample, and different colors represent different groups.Pvalue is at the right most, *denotes 0.01

图4 烟田土壤微生物在属水平上的物种差异分析

Fig.4 Species difference analysis of soil microorganism on the genus level in tobacco fields

真菌(图4-b)在属水平上列出丰度排名前10的物种，其中子囊菌门下的属(Norank_p_Ascomycota)、假霉样真菌属(Pseudallesch)表现为处理组低于对照组，而油脂酵母菌属(Lipomyce)、真菌域下的属(Norank_k_Fungi)表现为处理组高于对照组。除此之外差异达到显著的物种均为处理组高于对照组。

3 结论与讨论

将有机肥与拮抗微生物相结合制成生物有机肥的优点在于有机肥可为拮抗微生物提供足够的营养物质，使其容易在土壤中定殖，从而有效地抑制病原菌的生长，实现防控作物土传病害和提高作物产量的目的[1]。本试验中，随着烟株生长土壤中细菌数目呈现出先减少后增多的趋势，且在旺长期对土壤微生物的数量和群落结构影响最大，细菌和放线菌在旺长期数量最多。处理组中细菌数量显著高于对照组，表明生物有机肥中的微生物能很好地在土壤中定殖。

施用生物有机肥不但可以影响烟株根际土壤微生物的区系结构，还可以调节微生物的群落多样性。通过细菌群落的Alpha多样性分析可以看出，在处理组中各微生物多样性指数均为处理组高于对照组，表明施用生物有机肥可以明显增加土壤微生物的物种数目、生物多样性及群落丰度。研究表明，健康水平与微生物的多样性相关，高水平的微生物多样性能够抑制土传病害的发生，提高土壤质量[15-17]。本研究结果与其一致。这说明生物有机肥提高了土壤微生物整体代谢活性，增加了土壤微生物的群落多样性和功能多样性，进而提高土壤的生态功能，对防控病害有着积极的作用[18]。

通过对物种组成及物种差异的分析表明，旺长期烟株根际土壤微生物区系变化最为显著，变形菌门(Proteoacteria)等优势菌种在旺长期所表现出的差异最为明显。大量有益菌如微球菌科(Microco-ccaceae)下的属、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)的丰度在旺长期由处理组略低于对照组，变为处理组高于对照组。研究结果表明，微球菌科的相对丰度在健康土壤中明显高于感染青枯病的土壤，推测微球菌在健康土壤中对阻止青枯菌的入侵起到了一定的作用[19],而链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)被认为对控制烟草青枯病具有很好的效果[20]。推测旺长期是有益菌发生变化的关键时期，其原因可能是旺长期烟株根系大量可溶性的分泌物为细菌提供了足够的有效性碳源[21]，从而对根际微生物产生显著影响，使得根际微生物的区系结构朝一定的方向转变，这一点也能在本研究样本层级聚类图中得到验证。施用生物有机肥会增加烟株根际微生物区系中有益菌的丰度，而这些有益菌如链霉菌属(Streptomyces)可产生抗生素、杀虫剂、除草剂、植物生长促进剂等多种活性物质。另外，许多芽孢杆菌属(Bacillales)能分泌大量的酶和抗生素，可以抑制青枯雷尔氏菌的生长[22]，这些有益菌可能影响了青枯病的发生。在烟田中施用生物有机肥可以有效降低烟草青枯病的发生，防控率为38.2%，起到了较好的防病效果，而连续施用生物有机肥，逐渐改善烟株根际土壤微生物区系，才能使其达到更好的田间防效[23]。在烟株根际土壤微生物区系结构变化最关键的旺长期继续施用生物有机肥或其他措施，评价其对烟株根际微生物区系结构的影响及能否达到更好的防控效果，为本试验下一阶段的研究方向。