莱氏绿僵菌Nr0815分生孢子在化学农药中的相容性

杜广祖,张小娇,罗 艳,陈 斌,张立敏,2

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201； 2.云南农业大学 国际学院，云南 昆明 650201)

莱氏绿僵菌作为昆虫病原真菌的一种，在田间发生流行普遍，寄主范围广泛，特别是对夜蛾类害虫(甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等)具有很强的致病力，是极具开发利用潜力的虫生真菌。但与其他虫生真菌一样，该菌在田间易受外界环境的影响，自然流行易受抑制。目前，化学农药仍是防治害虫的重要制剂，因此，化学农药也成为影响昆虫病原真菌在害虫种群内自然流行的重要因素之一[1]。真菌孢子对农药的敏感性与菌株种类、农药品种和使用浓度有关[2-3]，若两者能相容，既能大幅度降低化学农药使用量，达到增效作用[3-4],又能减缓或克服害虫抗药性的产生[5]。据报道，已有多种化学杀虫剂与昆虫病原微生物杀虫剂进行混配用于农业害虫的防治，并取得了良好的防治效果[6-8]。昆虫病原真菌从接触寄主、孢子萌发到侵入昆虫体壁后在昆虫体内繁殖消耗寄主体内营养，至引起昆虫的死亡，需要一定的时间，因此，与化学农药的作用时效相比，其侵染致病具有时滞效应，这也是影响虫生真菌制剂杀虫效果及推广应用的重要因素之一。

对昆虫病原真菌与化学农药的相容性及其增效作用的研究一直是昆虫病原真菌开发研究的重要内容。鉴于此，选择在田间发生流行较强的莱氏绿僵菌菌株Nr0815，通过研究市场常用化学农药对该菌分生孢子萌发、菌丝生长、产孢量的影响等，明确莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子在常见化学农药中的相容性，并筛选出与莱氏绿僵菌菌株Nr0815具有相容性的化学农药，为缩短该菌对害虫侵染致病的时滞效应、利用该菌进行害虫防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 莱氏绿僵菌菌株Nr0815，分离自云南省昆明市晋宁县花椰菜田中的罹病银纹夜蛾虫体，室内纯化后保存于4 ℃冰箱备用。

1.1.2 供试农药 供试农药包括除草剂2种(68%草甘膦铵盐可溶粒剂、200 g/L百草枯水剂)、杀菌剂3种(75%百菌清可湿性粉剂、80%多菌灵可湿性粉剂、65%代森锌可湿性粉剂)、杀虫剂2种(24%灭多威可溶液剂、20%甲氰菊酯乳油)，均为市售产品。参考李增智等[9]和花立民[10]的方法，每种供试化学农药测定3种质量浓度，包括A：田间最大推荐使用质量浓度(以下称推荐质量浓度)；B：田间最大推荐使用质量浓度的5倍稀释液；C：田间最大推荐使用质量浓度的10倍稀释液。以清水作为对照(CK)。各化学农药的质量浓度见表1。

表1 供试化学农药相关信息Tab.1 Chemical pesticides tested in this study

1.2 试验方法

1.2.1 供试农药对孢子萌发的影响 先将配制好的化学农药滴入24孔细胞培养板的小孔穴中，在各质量浓度药液中加入等量的含5%蔗糖的菌悬液(2.1×107个/mL)，并调到所需质量浓度。然后在培养皿底垫1层打湿的滤纸，并在其上放1张载玻片，在载玻片中央交叉放置另1张洁净载玻片，上铺1张用打孔器均匀打有 4个小孔的滤纸条。最后将配制好的农药和菌悬液的混合液分别滴入4个孔中，盖好皿盖，25 ℃下保湿培养，每处理重复 3 次。分别于24、48、72 h后取出培养皿，依次镜检各处理的孢子萌发情况，以不加农药的菌悬液为对照。每处理观察300个孢子。孢子的萌发率=萌发数/观察总数×100%。

1.2.2 供试农药对菌丝生长的影响 参考徐艳聆等[11]的方法，分别吸取1 mL供试农药稀释液于培养皿内，倒入9 mL融化后冷却至45 ℃左右的SDAY培养基，迅速旋转，充分混匀，冷却凝固制成含药平板。将直径为5 mm的菌饼接入含药平板中心，7 d后用十字交叉法测量菌落直径，以加入无菌水的培养基为对照。每处理重复3次。

抑制率=(对照培养皿菌落直径-加药培养皿菌落直径)/对照培养皿菌落直径×100%。

1.2.3 供试农药对产孢量的影响 将供试菌株分别接种至含有不同农药的培养平板上，(25±1)℃条件下培养14 d后用直径5 mm的打孔器距平皿边缘等距处随机打取3 块菌块，加入200 mL含0.05%吐温-80的无菌水中，制成孢子悬浮液。用快速混匀器振荡5 min,使孢子充分分散。用纱布过滤，逐步稀释100倍。在盖好盖玻片的血球计数板上，用微量移液枪吸取孢子悬浮液，在光学显微镜下检查并计数。每个处理重复3次，取其平均值，按下述公式计算产孢量(孢子粉含孢量)：

产孢量=平均每小格孢子数×400×10 000×稀释倍数。

1.3 数据统计分析

孢子萌发率、菌丝生长抑制率、产孢量的差异利用SPSS 20.0软件分析，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发的影响

从表2可以看出，与对照相比，各供试农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子的萌发具有不同程度的抑制作用，加入各农药后其分生孢子的萌发率均在50%以下；同一农药随着处理质量浓度的降低其抑制作用均呈现减弱的趋势，且在处理后24～72 h随着时间的推移孢子萌发率均呈现不同程度的增长；同一时间、同种质量浓度下不同化学农药间孢子萌发率均存在显著性差异(24 h时，A：F=1 228.83,P=0.00；B：F=1 270.90,P=0.00；C：F=964.13,P=0.00。48 h时，A：F=1 408.71,P=0.00；B：F=743.43,P=0.00；C：F=263.39,P=0.00。72 h时，A：F=382.60,P=0.00；B：F=640.97,P=0.00；C：F=317.03,P=0.00)。

表2 化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发的影响Tab.2 Effect on conidia germination of M.rileyi stain Nr0815 by chemical pesticides

续表2 化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发的影响Tab.2(Continued) Effect on conidia germination of M.rileyi stain Nr0815 by chemical pesticides

注：同列数据后不同大写字母表示不同农药同一质量浓度下差异显著(P<0.05)，同列数据后不同小写字母表示同一农药不同质量浓度下差异显著(P<0.05)。

Note：Different capital letters in the same column indicate significant difference among different pesticides treatments at the same concentration(P<0.05),different small letters in the same column indicate significant difference among different concentration treatments of the same pesticide(P<0.05).

加入农药后24 h时，对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发率的测定结果表明，各农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发均具有明显的影响，分生孢子萌发率显著低于对照(表2)。其中，68%草甘膦铵盐可溶粒剂对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发的影响最小，孢子萌发率均高于在其余大部分农药中的萌发率，在68%草甘膦铵盐可溶粒剂推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液中分生孢子萌发率分别为(6.45±0.40)%、(8.44±0.68)%、(8.89±0.73)%。其次是200 g/L百草枯水剂处理，在推荐质量浓度、5倍和10倍稀释液中分生孢子萌发率分别为(5.89±0.59)%、(6.56±0.48)%、(7.67±0.19)%。而在75%百菌清可湿性粉剂中，莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发率最低，在推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液中分生孢子萌发率分别为(1.22±0.11)%、(1.44±0.11)%、(1.67±0.19)%。从供试农药不同质量浓度下莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发率差异来看，莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发率在75%百菌清可湿性粉剂(F=2.40,P=0.17)和24%灭多威可溶液剂(F=0.15,P=0.86)2种农药中无显著性差异，其余5种化学农药不同质量浓度间均存在显著性差异[200 g/L百草枯水剂(F=6.48,P=0.03)、68%草甘膦铵盐可溶粒剂(F=5.49,P=0.04)、65%代森锌可湿性粉剂(F=65.58,P=0.00)、80%多菌灵可湿性粉剂(F=30.45,P=0.00)、20%甲氰菊酯乳油(F=29.22,P=0.00)]。

加入农药后48 h时，对莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发率的测定结果表明，相同浓度下，68%草甘膦铵盐可溶粒剂和200 g/L百草枯水剂处理中莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子萌发率整体上高于其他农药处理，对莱氏绿僵菌分生孢子萌发的影响较小。其中，在68%草甘膦铵盐可溶粒剂推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液中莱氏绿僵菌分生孢子萌发率分别为(15.56±1.11)%、(23.89±2.00)%、(33.33±3.85)%；在200 g/L百草枯水剂推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液中莱氏绿僵菌分生孢子萌发率分别为(10.45±1.13)%、(13.00±0.84)%、(15.89±1.93)%。从莱氏绿僵菌分生孢子在推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液中的萌发率来看，200 g/L百草枯水剂(F=6.84,P=0.03)、75%百菌清可湿性粉剂(F=8.89,P=0.02)、24%灭多威可溶液剂(F=6.45,P=0.03)3种农药不同质量浓度间均存在显著性差异；65%代森锌可湿性粉剂(F=18.65,P=0.00)、68%草甘膦铵盐可溶粒剂(F=11.83,P=0.00)、80%多菌灵可湿性粉剂(F=30.90,P=0.00)、20%甲氰菊酯乳油(F=49.95,P=0.00)4种农药不同质量浓度间均存在极显著性差异。

加入农药后72 h时，不同质量浓度间分生孢子的萌发率除了75%百菌清可湿性粉剂(F=1.57,P=0.28)无显著性差异外，其他6种农药不同质量浓度间均存在极显著性差异(68%草甘膦铵盐可溶粒剂：F=34.67,P=0.00；200 g/L百草枯：F=21.95,P=0.00；80%多菌灵可湿性粉剂：F=11.98,P=0.00；65%代森锌可湿性粉剂：F=33.60,P=0.00；24%灭多威可溶液剂：F=100.14,P=0.00；20%甲氰菊酯乳油：F=17.89,P=0.00)。

就除草剂而言，68%草甘膦铵盐可溶粒剂对分生孢子萌发率的抑制作用相对较小，加入农药后72 h时在推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液中的萌发率分别为(22.00±3.40)%、(37.33±1.20)%、(47.11±0.91)%。就杀菌剂而言，80%多菌灵可湿性粉剂的抑制作用较小，加入农药后72 h时在推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液中的萌发率分别为(17.33±0.51)%、(19.44±0.80)%、(22.55±0.91)%。就杀虫剂而言，20%甲氰菊酯乳油的抑制作用较小，加入农药后72 h时在推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液中的萌发率分别为(15.33±1.84)%、(29.33±1.84)%、(31.11±2.41)%。而24%灭多威可溶液剂72 h时孢子萌发率最高的仅为(21.33±0.33)%。

综合以上结果，莱氏绿僵菌菌株Nr0815分生孢子对化学农药较为敏感，分生孢子在供试的68%草甘膦铵盐可溶粒剂、200 g/L百草枯水剂、75%百菌清可湿性粉剂、80%多菌灵可湿性粉剂、65%代森锌可湿性粉剂、24%灭多威可溶液剂、20%甲氰菊酯乳油中的相容存贮性差，不宜用于降低莱氏绿僵菌菌株Nr0815杀虫时滞效应。

2.2 化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815菌丝生长的影响

从表3可以看出，同一质量浓度不同化学农药或不同质量浓度同一化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815菌丝生长均有不同程度的抑制作用，且抑制率均在65%以上。在推荐质量浓度下不同化学农药对菌丝生长抑制率存在显著性差异(F=2.77，P=0.03)，抑制率从大到小依次为75%百菌清可湿性粉剂>24%灭多威可溶液剂>65%代森锌可湿性粉剂>80%多菌灵可湿性粉剂>200 g/L百草枯水剂>20%甲氰菊酯乳油>68%草甘膦铵盐可溶粒剂，其中68%草甘膦铵盐可溶粒剂菌丝生长抑制率为(72.79±2.49)%；其他质量浓度下不同化学农药对菌丝生长抑制率均无显著性差异(B：F=0.98，P=0.45；C：F=0.77，P=0.60)。同种化学农药不同质量浓度对菌丝生长的抑制率均无显著性差异(68%草甘膦铵盐可溶粒剂：F=0.57,P=0.58；200 g/L百草枯水剂：F=0.72,P=0.50；75%百菌清可湿性粉剂：F=1.96,P=0.18；80%多菌灵可湿性粉剂：F=0.85,P=0.45；65%代森锌可湿性粉剂：F=2.02,P=0.17；24%灭多威可溶液剂：F=0.87,P=0.44；20%甲氰菊酯乳油：F=0.67,P=0.53)。

表3 化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815菌丝生长的抑制作用

注：同列数据后不同大写字母表示不同农药同一质量浓度下差异显著(P<0.05),同行数据后不同小写字母表示同一农药不同质量浓度下差异显著(P<0.05)，下同。

Note：Different capital letters in the same column indicate significant difference among different pesticides treatments at the same concentration(P<0.05),different small letters in the same row indicate significant difference among different concentration treatments of the same pesticide(P<0.05),the same below.

2.3 化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815产孢量的影响

从表4可以看出，与对照[(1.33±0.42)×109个/mL]相比，化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815的产孢量均有不同程度的抑制作用,且抑制作用均随着化学农药质量浓度的降低而减弱。当质量浓度不变时，不同化学农药处理莱氏绿僵菌菌株Nr0815的产孢量均存在显著性差异(A:F=14.65,P=0.00;B:F=5.22,P=0.005;C:F=4.49,P=0.01)。同一化学农药不同质量浓度处理产孢量均存在显著性差异(68%草甘膦铵盐可溶粒剂：F=10.26,P=0.02；200 g/L百草枯水剂：F=11.06,P=0.01；75%百菌清可湿性粉剂：F=9.15,P=0.02；80%多菌灵可湿性粉剂：F=28.23,P=0.00；65%代森锌可湿性粉剂：F=5.93,P=0.04；24%灭多威可溶液剂：F=46.36,P=0.00；20%甲氰菊酯乳油：F=6.34,P=0.03)。

就除草剂而言，68%草甘膦铵盐可溶粒剂对莱氏绿僵菌产孢量的抑制作用较小，在推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液处理后产孢量分别为(4.93±0.44)×108、(8.73±1.43)×108、(10.59±0.44)×108个/mL；就杀菌剂而言，65%代森锌可湿性粉剂对莱氏绿僵菌菌株Nr0815产孢量的抑制作用较小，在推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液处理后产孢量分别为(2.20±0.61)×108、(3.37±1.04)×108、(7.23±1.45)×108个/mL；就杀虫剂而言，20%甲氰菊酯乳油对莱氏绿僵菌菌株Nr0815产孢量的抑制作用较小，在推荐质量浓度及其5倍、10倍稀释液处理后产孢量分别为(4.70±0.23)×108、(6.60±1.52)×108、(9.40±0.56)×108个/mL。

表4 化学农药对莱氏绿僵菌菌株Nr0815产孢量的影响Tab.4 Effect on sporulation quantity of M.rileyi stain Nr0815 by chemical pesticides 108个/mL

3 结论与讨论

本研究中，杀菌剂与莱氏绿僵菌菌株Nr0815的相容性明显低于杀虫剂和除草剂，且质量浓度越高抑制作用越强，这与之前的研究结果一致[3,12-14]。因此，如何改良和筛选耐杀菌剂的虫生真菌菌株，扩大杀菌剂与杀虫真菌农药混用面积，还需要进一步研究。

24%灭多威可溶液剂的3种质量浓度对菌丝生长的抑制率均在65%以上，高于邱思鑫等[1]的研究结果。且72 h时孢子萌发率最高仅为(21.33±0.33)%，低于郭亚力等[14]的研究结果，这可能由菌株本身的差异、农药生产厂家或农药有效成分不同所致。

从农药的防治对象来看，除草剂对菌株Nr0815的孢子萌发率、菌丝生长抑制率和产孢量影响相对较小，其次为杀虫剂，而杀菌剂的影响最强。原因可能如下：与除草剂和杀虫剂相比，杀菌剂的作用机制不同，杀菌剂主要通过影响真菌细胞的结构和功能、细胞能量生成、细胞代谢物质合成及其功能等方面来杀死或抑制真菌[15-16]。莱氏绿僵菌属于真菌的一种，结构和代谢功能与植物病害真菌相似。

在含有不同化学农药的SDAY培养基上莱氏绿僵菌菌株Nr0815菌丝生长不同，后期均有绿色的分生孢子粉产生，且产孢量存在一定的差异，说明化学农药对该菌会产生一定的抑制作用，但并未将分生孢子全部杀死。JOHNSON等[17]研究发现，莱氏绿僵菌分生孢子采用杀菌剂或除草剂处理后对甘蓝银纹夜蛾的感染死亡数量明显减少，这也可能是该菌在田间得以存活并在条件适宜情况下发生流行的原因之一。

此外，有研究报道铜绿丽金龟幼虫、棉铃虫幼虫、小菜蛾幼虫经过Bt预处理后分别对氰戊菊酯和有机磷及氨基甲酸酯杀虫剂的敏感性提高。分析结果表明，Bt预处理后的铜绿丽金龟幼虫、棉铃虫幼虫和小菜蛾幼虫体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性被抑制[18-20]。万成松等[21]研究也发现，棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)与化学杀虫剂混用时能抑制多功能氧化酶(MFO)、AChE等相关酶活性。因此，感染莱氏绿僵菌初期的夜蛾类幼虫对杀虫剂的敏感性是否会提高，以及其作用机制是否与Bt或病毒一样抑制相关酶类的活性，均有待进一步研究。