水通道蛋白4在肠道病毒71引起的手足口病患儿口腔黏膜中的表达及临床价值

肖青锋，邴小三

手足口病是一种传染性病毒性疾病，主要对象为婴幼儿[1]。该疾病主要表现为发热，手、足、臀部水疱疹，口腔黏膜溃疡。手足口病的暴发主要由两种肠道病毒引起：肠道病毒71和柯萨奇病毒A16。通常，手足口病是自限性的，但小部分儿童可能会经历严重的并发症，如脑膜炎、脑炎、急性迟缓性麻痹和神经源性肺水肿[2-3]。因此，对手足口病的发病机制、诊断和治疗的研究仍然具有重要的临床意义。病毒侵入中枢神经系统可引起脑水肿和损伤，可进一步诱发交感神经兴奋、儿茶酚胺释放、全身炎性反应和免疫损伤，并最终导致神经源性肺水肿和其他严重并发症。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是跨膜通道蛋白，能使水和其他小溶质（如甘油）在细胞间选择性转运[4]。已证实水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP-4）与脑水肿的发生和发展密切相关[5]。本研究旨在通过检测儿童肠道病毒71相关手足口病患儿口腔黏膜中AQP-4的表达，为临床判断病情和预后提供帮 助。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究选取2016年1月－2019年1月襄阳市中心医院收治的100例肠道病毒71引起的手足口病患儿为病例组，同期入院体检的100例健康儿童为对照组。根据中国手足口病防治指南，对100例肠道病毒71引起的手足口病患儿进行临床分期。

1.1.1 入组标准①符合诊断标准[6]的肠道病毒71引起的手足口病患儿；②年龄3～12岁，性别不限；③健康儿童无呼吸道疾病史；④健康儿童无手足口病接触史；⑤临床资料完整者。

1.1.2 排除标准①合并风疹者；②合并疱疹性咽峡炎者；③合并神经源性肺水肿者；④合并恶性肿瘤者。

1.2 研究方法

1.2.1 检测方法患儿入院后常规水银体温计检测患儿体温，电子血压计测量血压，治疗前，从口腔处获取口腔黏膜样本，清晨空腹状态下从肘关节处抽取静脉血5 mL；治疗7 d后，从口腔处获取口腔黏膜样本，空腹状态下从肘关节处抽取静脉血5 mL。健康儿童于入院后按照相同操作采集口腔黏膜样本和血液样本5 mL。所取得的口腔黏膜、血液样本立即送往实验室采用商业酶联免疫吸附试验（ELISA）测定C反应蛋白（CRP）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、AQP-4和神经原特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）的水平，所有测定均按照ELISA说明书进行，所有样品均一式两份。检测仪器为美国Bio-Bad全自动酶标仪，AQP-4试剂盒购于中国武汉博士德生物工程有限公司，CRP、CK、CK-MB、NSE试剂盒购自美国R&D公司。

1.2.2 观察指标①搜集两组儿童性别、年龄等基线资料并进行比较；②比较两组儿童血清CRP、CK、CK-MB表达水平；③比较两组儿童血清、口腔黏膜中的AQP-4表达水平；④比较不同临床分期患儿治疗前基线资料；⑤比较不同临床分期患儿治疗前后口腔黏膜中AQP-4表达水平和NSE表达水平。

1.3 统计学处理

本研究中数据全部采用SPSS 20.0统计分析软件（美国IBM公司）进行处理；计量资料采用“均数±标准差”表示，多组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，多组间比较采用χ2分析；P＜0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 健康儿童与手足口病患儿基线资料比较

调查结果显示，两组儿童年龄、性别等基础资料差异均无统计学意义（P＞ 0.05），病例组患儿平均病程（92.8±20.2）d，见表1。

2.2 健康儿童与手足口病患儿血清CRP、CK、CK-MB水平比较

病例组患儿血清CRP、CK、CK-MB水平均高于对照组，且两组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1健康儿童与手足口病患儿基础资料比较Table 1 Baseline data of the children with hand，foot，and mouth disease versus healthy children

表2健康儿童与手足口病患儿血清CRP、CK、CK-MB水平比较Table 2 Serum levels of C-reactive protein，creatine kinase，and creatine kinase isoenzyme in healthy children versus children with hand，foot，and mouth disease

2.3 健康儿童与手足口病患儿血清、口腔黏膜中的AQP-4表达水平比较

病例组患儿血清、口腔黏膜中的AQP-4表达水平均高于对照组，且两组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3健康儿童与手足口病患儿血清、口腔黏膜中的AQP-4表达水平比较Table 3 AQP-4 expression levels in serum and oral mucosa of healthy children versus children with hand，foot，and mouth disease

2.4 不同临床分期患儿治疗前后口腔黏膜中AQP-4表达水平比较

治疗前，不同疾病分期患儿口腔黏膜中AQP-4表达水平由低到高依次为临床1期、2期、3期，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，不同疾病分期患儿口腔黏膜中AQP-4表达水平均低于治疗前相应各期，且由低到高依次为临床1期、2期、3 期，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4不同临床分期手足口病患儿治疗前后口腔黏膜中AQP-4表达水平比较Table 4 AQP-4 expression levels in oral mucosa of children with hand，foot，and mouth disease in terms of clinical stage before and after treatment

2.5 不同临床分期患儿治疗前后口腔黏膜中NSE表达水平比较

治疗前，不同临床分期患儿口腔黏膜中NSE表达水平由低到高依次为临床1期、2期、3期，差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，不同临床分期患儿口腔黏膜中NSE表达水平均低于治疗前相应各期，且由低到高依次为临床1期、2期、3 期，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5不同临床分期患儿治疗前后口腔黏膜中NSE表达 水平比较Table 5 Neuron-specific enolase expression levels in oral mucosa of children in terms of clinical stage of hand，foot，and mouth disease before and after treatment

3 讨论

手足口病是一种常见的传染病，主要感染10岁以下的儿童，主要临床表现为发热、手、脚、臀部水疱疹、口腔黏膜溃疡。大多数症状是自限性和轻度的，潜伏期为3～6 d，早期症状是低热、咳嗽和喉咙痛，逐渐恶化为虚弱和食欲不振。在最初的症状之后，发疹开始时是带有水疱的丘疹，最后变成溃疡。病变通常发生在口腔内，包括颊黏膜、硬腭、面颊表面、牙龈和舌头，而手掌和脚底，臀部和生殖器区域偶尔也会出现病变[7]。即使在手足口病期间临床特征相似，某些特定方面也经常与特定病毒相关。在肠道病毒71引起的感染中，皮疹本质上是瘀点和/或丘疹，主要分布在躯干和四肢。手足口病可导致严重的并发症，包括肌阵挛发作、震颤、眼球震颤、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹性疾病。在某些情况下，还观察到心动过速、肺水肿/出血和心肺衰竭导致的立即死亡。手足口病目前还没有有效的治疗药物或疫苗接种。因此，制定有效遏制手足口病的预防和治疗措施已成为许多国家的研究重点。

AQP是一个新发现的膜通道蛋白家族。1994年，Agre和Verkman的研究小组独立报告说，大脑表达了一种相当高量的AQP cDNA，这种AQP被称为汞不敏感水通道，后改名为AQP-4，免疫定位于整个大脑的室管膜细胞和星形胶质细胞。迄今为止，在哺乳动物组织中发现了13种AQP，这些蛋白在调节跨细胞膜的水流中起着重要作用[8]。AQP功能失调是导致某些疾病的原因，这些疾病与水平衡失调或自身免疫有关[9-10]。目前，AQP作为治疗学潜在的药物靶点的相关性已被广泛认可。免疫细胞化学显示，AQP-4在邻近脑微血管或脑表面皮亚尔覆盖的星形细胞质膜区域特别丰富。AQP-4也包含在突触周围的星形细胞中，但水平要低得多，即星形胶质细胞不仅在解剖学上，而且在蛋白质表达方面，都是高度极化的细胞。AQP-4是中枢神经系统的主要AQP，就人体定位而言，AQP-4在星形胶质细胞和与血管或脑脊液密切接触的不同组织中表达。AQP-4是大脑中最丰富的分子之一，在血-脑、脑脊液界面的星形细胞膜中尤为普遍。尽管AQP-4与许多病理生理过程有关，但它在大脑生理学中的作用仍不明确。近期有证据表明，AQP-4参与了细胞外空间容量调节、钾缓冲、脑脊液循环、间质液吸收、废物清除、神经炎症、渗透感觉、细胞迁移和钙信号传导等多种功 能。

近年来，AQP-4作为一种新的有希望的治疗靶点，引起了人们的极大关注。AQP-4在血-脑界面的高密度表达促使人们假设AQP-4控制着血-脑之间的水流量。哺乳动物大脑中最重要的AQP是AQP-4，其与大脑水肿和损伤密切相关[11-13]。国外研究团队发现，在AQP-4基因敲除后，缺血后脑水肿大大减少；在中风大鼠中的研究发现，AQP-4的表达与脑水肿严重程度呈正相关，抑制AQP-4可有效缓解脑水肿；另有研究表明，外伤性脑损伤患者脑脊液中AQP-4水平显著升高，AQP-4是评价外伤性脑水肿脑水代谢的灵敏的生化指标。现已证实AQP-4与多种水平衡紊乱（即耳聋、脑水肿形成、癫痫和狼疮性脑炎）有关[14-16]，在人类癫痫中，发现红细胞膜透水性有缺陷；在肌萎缩侧索硬化症中，胶质细胞维持的脑内稳态的失败被认为是神经细胞死亡的基础，在肌萎缩侧索硬化症的大鼠模型中发现了AQP-4的上调；除了在脑内水转运和离子稳态中的作用外，AQP-4还被证实影响包括β淀粉样蛋白在内的脑实质蛋白的清除。这些新的研究支持AQP-4介导的水转运强烈影响大脑中代谢物和离子的清除，不仅在脑内水平衡中起着重要作用，而且对脑实质分子清除也具有一定影响。脑功能不全是手足口病患儿严重并发症的先决条件，为此提出假设AQP-4可能参与手足口病患儿脑水肿和损伤的病理过程。该病临床2期是神经系统受累期；临床3期是心肺功能衰竭前期，极大多数在5岁以下，尤其1～3岁儿童发病后易转入临床2、3期。本研究发现，肠道病毒71引起的手足口病患儿口腔黏膜中AQP-4表达水平高于健康儿童，且AQP-4表达水平随着疾病严重程度的增加而增加，治疗后AQP-4表达水平降低，推断AQP-4可能通过调控血-脑之间的水流量参与肠道病毒71引起的手足口病的发生、发展[17-18]。

综上所述，口腔黏膜中AQP-4表达水平与肠道病毒71引起的手足口病发生、发展以及预后相关。本研究的不足之处是受试者中没有3岁以下病例，该年龄段的病例收集工作将在后续研究中开 展。