耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌医院感染暴发调查及危险因素分析

王永红，周中丽，黄中秀，黄俊，文丰，马华兰

随着大量广谱抗菌药物的不合理使用，鲍曼不动杆菌（Aci net obact er baumanni i）耐药率呈快速升高趋势，特别是碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）导致的感染给患者治疗带来了极大困难[1]。而ICU作为危重症患者的收治科室，由鲍曼不动杆菌引起的医院感染较严重，常出现CRAB的克隆传播[2]。以下是针对重庆市黔江中心医院ICU 2017年12月24日－2018年2月12日发生的CRAB感染暴发事件进行的流行病学调查及危险因素分析。

1 材料与方法

1.1 调查及研究对象

20 1 7年1 2月24日－20 18年2月1 2日，本院ICU连续报告了8例CRAB引起的医院获得性肺炎（HAP），诊断标准依据卫生部2001年颁布的《医院感染诊断标准（试行）》[3]。具体纳入标准：①无明确潜伏期，规定入院4 8 h后发生的感染；②患者有发热、咳嗽，肺部听诊有湿啰音；③X线显示肺部有炎性浸润性病变；④血常规检查白细胞总数和/或嗜中性粒细胞比例增高。病原学检查痰液定量培养分离病原菌数需 ≥106CFU/ mL，人工气道吸引采集的下呼吸道标本病原菌数需≥105CFU/mL，且连续两次分离到相同病原体，或者血培养分离到病原体。

8例HAP患者从吸引痰中均分离到CRAB，因此以这期间该ICU所有住院患者及痰液和环境生物学监测标本中分离到的CRAB菌株为研究对象开展调查。

1.2 流行病学调查

1.2.1 确定感染暴发存在核实已报告的CRAB医院感染病例临床诊断及实验室诊断，排除非感染或实验室诊断错误导致的假暴发报告。调查该时间段CRAB医院感染罹患率：CRAB医院感染罹患率（%）=（该时间段CRAB医院感染新病例数/同期ICU患者数）×100%[4]，并将罹患率与上年同期进行比较。

1.2.2 现场调查收集患者人口统计学特征及相关临床资料，包括性别、年龄、床位、入出院时间、诊断、微生物培养结果、药物敏感试验结果、抗菌药物使用情况、侵袭性操作、基础疾病等。同时对ICU的监护仪表面、输液泵按钮、治疗车、床头柜、床架、呼吸机表面、电脑键盘和鼠标及医务人员手和鼻腔进行规范采样，标准参照2012年发布《医疗机构消毒技术规范》。将采样棉拭子放入装有10 mL无菌检验用洗脱液的试管中送检。取洗脱液1 mL接种培养基平皿，置于37 ℃孵箱，培养48 h后计数菌落数，并对目标菌落进行菌种鉴定。

1.2.3 同源性分析对患者分离到的CRAB菌株及环境采集标本分离到的CRAB菌株进行同源性分 析。

1.2.4 暴发危险因素推测根据现场调查收集资料为依据，采用病例对照研究。将8例CRAB引起的HAP患者作为病例组（CRAB组），42例同时期入住综合ICU＞48 h并排除有医院感染的患者作为对照组（非CRAB组）进行危险因素单因素分析。8例病例组与40例对照组（从42例对照组患者中以进入ICU时间为条件筛选40例与病例组配对）进行1∶5配对logistic回归分析。

1.3 实验室检测

1.3.1 细菌鉴定及药敏试验气管插管机械通气患者，痰标本采集由医护人员经管道吸出痰液，置于带螺纹盖的无菌容器中送检。同时，病原菌的培养、分离、鉴定及药敏均参照《全国临床检验操作规程》标准执行[5]。鉴定及药敏分析仪为法国生物梅里埃VITEK 2-Compact，药敏折点参照CLSI 2018年标准进行。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853。CRAB组痰培养分离到CRAB 8株，剔除同一患者的重复菌株。环境生物学监测标本中分离到CRAB 5株。

1.3.2 碳青霉烯酶耐药基因检测菌落采用37 ℃过夜培养18～24 h纯菌落，DNA提取按照DNA抽提试剂盒说明书进行。引物参照文献[6]，引物序列见表1。PCR反应体系（40 µL）：premix Ta q酶2 0µL，上下游引物各0.8µL（浓度为10 µmol/ L），DNA模板4 µL，超纯水14.4 µL。扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s、退火30 s（退火温度见表1）、72℃延伸30 s共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增完毕，PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，选取阳性产物送测序。测序结果在NCBI上进行BLAST比对。

表1鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因引物序列Table 1 Primers and their sequence for amplifying carbapenemase genes in Acinetobacter baumannii strains

1.3.3 脉冲场凝胶电泳（PFGE）参照文献制备DNA胶块、细胞壁裂解、洗胶、胶块DNA酶切、加样、电泳等[7]。电泳条件为：温度14 ℃，电泳时间22 h，电泳方向角度变化120°，电压6 V/cm，线性梯度变化5～20 s。应用BioNumerics软件对图像进行聚类分析，条带完全相同判定为同一克隆株，条带差异1～3条判定为亚克隆株。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行分析，用χ2检验分析二分类变量资料；计量资料以±s表示，采用t检验分析；危险因素多因素分析采用1∶5配对logistics回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况

2017年12月24日－2018年2月12日ICU共发生8例CRAB所致医院获得性下呼吸道感染，结合临床表现、影像学检查及实验室检查确定该8例患者为感染而非定植或污染。在该时间段内，CRAB医院感染新病例数为8例，同时期ICU患者总数为89例，CRAB医院感染罹患率为9.0%（8/89），较上年同期CRAB医院感染罹患率1.2%（1/82）明显升高。根据绘制的CRAB感染病例时间轴图（见图 1），确定2017年12月26日分离到CRAB的患者P1为初始病例，2018年2月12日分离到CRAB的患者P8为末尾病例。8例患者基本情况见表2。

2.2 环境微生物学调查

综合I CU共采集4 6份环境表面及医务人员手和鼻拭子标本，其中3 2份标本总菌落数超过国家标准（＞5 CFU/cm2），不合格率为69.6%（32/46），6份医务人员手的标本菌落数超标，均不合格。同时，CRAB检出率为10.9%（5/46），其中监护仪CRAB检出率为2/8，医务人员手为1/6，输液泵按钮为1/6，治疗车为1/8，其他床头柜按钮、床架、电脑键盘鼠标、呼吸机表面、医务人员鼻拭子均未检出CRAB。

图1 8例CRAB感染病例时间轴和床位分布情况Figure 1 Timeline and bed occupancy of all the eight patients with carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii infection

表2 8例CRAB下呼吸道感染患者基本情况Table 2 Basic condition of 8 patients with lower respiratory tract infection caused by carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

2.3 病原学鉴定及药敏

从患者分离到的8株CRAB中，第1、3、4、5菌株药敏结果相同，第2、6、7、8菌株药敏结果相同。药敏结果提示8株CRAB耐药表型相似，疑似暴发。患者痰标本分离的CRAB药敏结果见表 3。

2.4 病例空间分布

综合ICU共15张病床，大厅8张，大间4张，3张小间隔离床位。所有感染患者均位于大厅床 位。

2.5 耐药基因检测及同源性分析

对从环境中分离到的5株鲍曼不动杆菌和患者分离到的8株鲍曼不动杆菌进行耐药基因检测和PFGE同源性分析。所有菌株均携带OXA-23、OXA-51基因，未检测到KPC、IMP、NDM及其他OXA基因。PFGE结果提示患者和环境分离菌株为同一克隆，共有2个亚群A1和A2。结果见图2、图 3。

2.6 危险因素分析结果

采用病例对照研究，将CRAB组和非CRAB组按基本信息、抗菌药物使用相关因素、侵袭性操作相关因素、ICU相关因素及基础疾病分类进行比较分析。危险因素的单因素分析结果显示检出细菌前使用抗菌药物时间、机械通气、气管插管/切开、留置引流管、入住ICU天数、手术、混合感染为CRAB医院感染暴发的危险因素，P＜0.05。见表 4。

将单因素分析中有统计学意义（P＜0.05）的因素进行1∶5配对logistic回归分析，结果未发现独立危险因素，见表5。

表3 8株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌药敏结果Table 3 Antimicrobial susceptibility patterns for 8 carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains

图3 5株环境调查分离菌株和8株患者分离菌株PFGE及耐药基因分析Figure 3 Pulsed-field gel electrophoresis and resistance gene analysis of the Acinetobacter baumannii isolated from ICU patients（n=8） and environment （n=5）

表4 CRAB医院感染危险因素的单因素分析Table 4 Univariate analysis of risk factors for healthcare-associated infections caused by carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

表5 CRAB医院感染危险因素的1∶5配对logistic回归分析Table 5 Matched （1∶5） logistic analysis of risk factors for healthcare-associated infections caused by carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii

3 讨论

2017年全国细菌耐药监测网数据显示，鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药率为56.1%。随着CRAB分离率的增高，由CRAB引起的医院感染暴发也严重威胁着人们的健康[8]。鲍曼不动杆菌引起的医院感染主要包括呼吸机相关性肺炎、血流感染、尿路感染等，特别是入住ICU的患者均有较高的感染风险[9]。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要机制包括：产β内酰胺酶（主要为B类和D类）、药物作用靶位的改变、外膜通透性改变及外排泵的过度表达[10]。其中，产酶机制是引起鲍曼不动杆菌耐药的主要因素，又以OXA基因的表达流行为主。本研究中，所有菌株均含有OXA-23和OXA-51基因，此两种亚型是D类β内酰胺酶中流行最广泛的基因。这也是本研究中分离的鲍曼不动杆菌呈高水平耐药的原因。

在本次感染暴发调查中，该ICU在较短时间（6周）内连续发生8例医院获得性CRAB下呼吸道感染，且均为入住综合ICU 48 h后发生的感染，CRAB感染罹患率较本底显著增高。此次CRAB下呼吸道感染流行病学特征是时间短、范围小，临床症状、影像学检查及病原菌耐药谱相似，排除定植和污染可能。同时通过PFGE分子流行病学方法证实下呼吸道感染分离CRAB菌株与环境分离CRAB菌株为同一克隆，调查结果证明该事件为一起CRAB引起的综合ICU医院感染暴发。

本研究中，单因素危险因素分析提示检出细菌前使用抗菌药物时间、机械通气、气管插管/切开、留置引流管、入住ICU时间、手术、混合感染可能为CRAB医院感染暴发的危险因素，但多因素条件logistic回归分析未发现独立危险因素。初诊患者P1因脑左侧基底节区出血于2017年12月24日手术后入住ICU，气管插管后呼吸机辅助通气，术后患者出现高热，于48 h后首次痰培养CRAB阳性，推测该患者入院前上呼吸道定植有CRAB菌株，经侵袭性操作后引起肺部感染，而成为本次感染暴发的首发病例。8例CRAB医院感染患者均伴有较严重的基础疾病导致免疫功能低下，如：多发伤、硬膜下血肿、胸部钝性伤和脑出血等，均处于昏迷状态，行气管切开、机械通气及引流管留置等操作，且执行上述操作的护理人员和医师均相对固定。环境微生物调查结果显示上述医务人员手标本菌落数均超标，同时分离到1株相同克隆CRAB。除此以外，在监护仪、输液泵和治疗车上采样标本中同样分离到相同克隆CRAB菌株。由此推断，患者P1为感染源，传播途径主要为医务人员未按要求严格执行手卫生，随着呼吸机使用、引流管使用、气管插管和气管切开等侵袭性操作的进行，导致了CRAB对环境的污染而在不同患者之间的水平传播。虽然本研究根据危险因素分析结果对首发病例的出现及其他病例CRAB医院感染的发生做了推测，但由于病例组例数较少，可能导致危险因素分析出现偏倚[11]。在此次暴发后期，通过加强医务人员手卫生依从性、彻底消毒、隔离和积极治疗，CRAB在ICU内传播得到有效控制，继续监测2个月再无新发病例发生。因此，严格进行环境物表消毒和医务人员手卫生，通过合理使用抗生素，积极隔离医院感染患者，可有效防控CRAB医院感染暴发及蔓延。