脂肪酶催化合成大豆甾醇共轭亚油酸酯的工艺研究

汤桂云，郑 玄，陈竞男

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

植物甾醇是甾族化合物中的一类仲醇，广泛存在于自然界中，在植物油、坚果和植物种子中含量较高[1-2]。研究发现，植物甾醇具有降胆固醇、抗癌、抗炎、抗氧化等十分重要的生理功能[3-6]，目前已被广泛应用于食品、药品、保健品等行业。游离型植物甾醇的水溶性和脂溶性均较差，生物利用率有限[7-8]，食品工业中常通过将其与脂肪酸酯化的方法进行改性。共轭亚油酸是一种不饱和脂肪酸，具有降低血液胆固醇、预防动脉粥样硬化、抗癌、抗氧化、提高机体免疫力、促进生长等多种生理功能[9-10]，但共轭亚油酸很不稳定，易发生氧化。因此，将植物甾醇用共轭亚油酸酯化，既可以有效提高植物甾醇的脂溶性和生物利用率，又可以提高共轭亚油酸的氧化稳定性，充分发挥其生理有效性。

近年来，植物甾醇共轭亚油酸酯合成越来越受到人们的关注，如Li等[11]用Chirazymel-2脂肪酶催化植物甾醇与共轭亚油酸合成植物甾醇共轭亚油酸酯，在酸醇物质的量比 1∶1，反应温度 50 ℃、反应时间72 h、酶用量20 mg/mL 的条件下，酯化率可达到 72.63%。朱振南等[12]以皱褶假丝酵母(Candidarugosa) 脂肪酶为催化剂，正己烷为有机溶剂，酯化反应温度为40 ℃，酯化反应时间为87 h，酸醇物质的量比为6∶1，酶的添加量为9.6%，在此工艺条件下植物甾醇共轭亚油酸酯的产率高达97.5%。虽然现在关于植物甾醇共轭亚油酸酯合成的研究有很多，但是一般反应时间较长，酶用量较大，而且其定性定量分析方法大多是采用气相色谱法，该法要先将植物甾醇酯皂化和衍生化处理，操作过程烦琐费时。采用正相高效液相色谱法无需将样品进行衍生化即可直接进样，操作简单省时且重复性好，但是目前采用正相色谱检测植物甾醇酯的方法却少有报道。

鉴于此，以大豆甾醇和共轭亚油酸为原料，采用正相高效液相色谱法对大豆甾醇共轭亚油酸酯进行定性定量分析，并通过单因素与正交试验，筛选出大豆甾醇共轭亚油酸酯的最佳工艺条件，为植物甾醇资源的高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆甾醇(纯度95%，其中β-谷甾醇45%、菜油甾醇26%、豆甾醇24%、菜籽甾醇4%)：武汉远成共创科技有限公司；共轭亚油酸(纯度95%)：金锦乐(上海)化学有限公司；正己烷：色谱纯，赛摩飞世尔科技(中国)有限公司；正丁醇、正己烷、异辛烷、丙酮、氯仿：分析纯，天津市科密欧有限公司；N435脂肪酶、CRL脂肪酶、CALA脂肪酶、CALB脂肪酶：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；RMIM脂肪酶：丹麦诺维信公司。

2695液相色谱仪(HPLC)：美国Waters公司；370DTGS傅里叶红外光谱仪：美国PE公司；电子天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；IKA型旋转蒸发仪：艾卡(广州)仪器设备有限公司；恒温磁力搅拌器：上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆甾醇共轭亚油酸酯标准样品的制备方法

在25 mL反应管中依次加入大豆甾醇109.0 mg、共轭亚油酸221.3 mg、催化剂CRL脂肪酶，催化剂用量(占大豆甾醇与共轭亚油酸质量之和的百分比)6%，密封置换空气后，充入氮气。然后用针管吸取5 mL的异辛烷加入反应管中，并将反应管置于50 ℃的恒温磁力搅拌器上反应48 h，即得到大豆甾醇共轭亚油酸酯粗产品。最后将大豆甾醇共轭亚油酸酯粗产品纯化(洗脱剂为正己烷、乙醚、冰乙酸，体积比为90∶10∶2)、旋蒸、冷冻干燥，即得到大豆甾醇共轭亚油酸酯标准样品(98.56%)。

1.2.2 大豆甾醇共轭亚油酸酯的合成方法

在25 mL反应管中依次加入一定量的大豆甾醇、共轭亚油酸、催化剂，密封置换空气后，充入氮气，然后用针管吸取一定量的反应溶剂加入反应管中，最后将反应管置于恒温磁力搅拌器上反应。

1.2.3 大豆甾醇共轭亚油酸酯正相高效液相色谱分析方法

色谱柱：硅胶色谱柱(5 μm×4.6 mm×250 mm)；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。等度洗脱，流动相体系B相为正己烷-异丙醇(体积比20∶1)，D相为正己烷，紫外检测波长232 nm。

1.2.4 大豆甾醇共轭亚油酸酯标准曲线的建立

准确称取制备合格的大豆甾醇共轭亚油酸酯20 mg，依次用正己烷稀释成200、100、80、50、40、20、10 μg/mL不同质量浓度梯度，建立大豆甾醇共轭亚油酸酯的标准曲线。通过HPLC检测获取线性回归方程，根据决定系数是否满足R2>0.999的要求，判断其拟合效果。

1.2.5 大豆甾醇共轭亚油酸酯的定量

将反应后的混合溶液离心后吸取上清液用正己烷定容至25 mL容量瓶中，再从中取出100 μL定容至10 mL容量瓶中，然后用高效液相色谱检测，并根据大豆甾醇共轭亚油酸酯的标准曲线，对大豆甾醇共轭亚油酸酯的产率进行计算。

大豆甾醇共轭亚油酸酯产率=

1.2.6 大豆甾醇共轭亚油酸酯产品的红外光谱分析

采用傅里叶红外光谱仪，全反射光谱法进行分析，采样32次，在4 500～400 cm-1对纯化后的大豆甾醇共轭亚油酸酯产品进行扫描，进行红外光谱分析。

1.2.7 数据处理

2 结果与讨论

2.1 大豆甾醇共轭亚油酸酯合成工艺的单因素试验

2.1.1 大豆甾醇共轭亚油酸酯的液相色谱图及标准曲线

以胆固醇亚油酸酯作为标准品对合成的大豆甾醇共轭亚油酸酯进行定性分析(图1)。胆固醇亚油酸酯的出峰时间约为4 min，大豆甾醇共轭亚油酸酯的出峰时间也约为4 min，与标准品的出峰时间一致。

制备大豆甾醇共轭亚油酸酯标准样品在 200、100、80、50、40、20、10 μg/mL质量浓度梯度下，根据峰面积和质量浓度绘制大豆甾醇共轭亚油酸酯的标准曲线(图2)，其中R2≥ 0.999，说明线性方程拟合效果良好。

图1 大豆甾醇共轭亚酸酯的液相色谱分析图

图2 大豆甾醇共轭亚酸酯的标准曲线

2.1.2 醇酸物质的量比对大豆甾醇共轭亚油酸酯产率的影响

理论上来讲，甾醇与共轭亚油酸醇酸物质的量比为1∶1即可完全进行酯化反应。但酯化反应是一种可逆反应，当反应达到平衡时，适当的增加反应底物，有利于反应正向进行[13]，大豆甾醇共轭亚油酸酯的酯化产率增加。由图3可知，当醇酸物质的量比从1∶0.5增加至1∶3时，增加共轭亚油酸的质量，大豆甾醇共轭亚油酸酯的产率增加，当醇酸物质的量比到达1∶3时，酯化产率达到最大值(95.13±1.64)%，继续增大醇酸物质的量比，大豆甾醇共轭亚油酸酯产率从(95.13±1.64)%降至(89.33±0.93)%，这是因为过量的共轭亚油酸会对脂肪酶CRL存在竞争抑制[14]，且共轭亚油酸的价格较贵，持续增加共轭亚油酸的质量会导致成本增加，并且过量的共轭亚油酸会增加后处理程序[15]，综合考虑，选择大豆甾醇共轭亚油酸酯化反应的醇酸物质的量比为1∶2。

反应条件：CRL, 5 mL异辛烷，40 ℃，12 h，酶用量8%注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著，图4、图5、图6同。

2.1.3 催化剂用量对大豆甾醇共轭亚油酸酯产率的影响

从图4可以看出，当酶的添加量从2% 增加到4% 时，大豆甾醇共轭亚油酸酯的产率从(59.10±1.60)%迅速增至(93.24±0.80)%，继续增大脂肪酶用量，大豆甾醇共轭亚油酸酯产率与4%时无显著性差异。这可能是因为当酶添加量达到4%时，脂肪酶已达到饱和，继续增大脂肪酶用量已不能提高产率。为了节约成本，选用酶用量为4%进行后续试验。

反应条件：CRL, 5 mL异辛烷，40 ℃，12 h，醇酸物质的量比1∶2

2.1.4 酯化反应温度对大豆甾醇共轭亚油酸酯产率的影响

反应条件：CRL, 5 mL异辛烷，12 h，醇酸物质的量比1∶2，酶用量4%

图5为反应温度对大豆甾醇共轭亚油酸酯产率的影响。在24～60 ℃的范围内，大豆甾醇共轭亚油酸酯的产率呈先上升后下降的趋势，这可能与酶的最适温度有关。在所选温度范围内，低温不能完全激发脂肪酶的活性，高温会导致部分脂肪酶的失活，而40～50 ℃是酶的最适温度，其中，40 ℃、50 ℃时的产率分别达(94.24±1.29)%、(94.67±1.13)%，并无显著性差异，因此，从降低能耗和可操作性方面考虑，将40 ℃作为反应温度进行后续试验。

2.1.5 酯化反应时间对大豆甾醇共轭亚油酸酯产率的影响

图6为反应时间对大豆甾醇共轭亚油酸酯产率的影响。当反应时间从12 h增加至48 h时，大豆甾醇共轭亚油酸酯产率显著增加，从(93.24±0.60)%升高至(97.50±0.39)%。继续延长反应时间至60 h，大豆甾醇共轭亚油酸酯产率稍有下降，从(97.50±0.39)%下降至(97.28±0.46)%。因此，选择反应时间 48 h 进行后续试验。

反应条件：CRL, 5 mL异辛烷，40 ℃，醇酸物质的量比1∶2，酶用量4%

2.2 大豆甾醇共轭亚油酸酯酯化条件的正交试验

根据单因素试验确定的因素和水平，采用正交试验设计确定最佳工艺条件， 正交试验因素与水平见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。

由表2和表3可知，各因素对产率的影响依次为B>A>D>C，即催化剂用量>醇酸物质的量比>酯化反应时间>酯化反应温度。因此，由正交试验得到最佳工艺为A3B3C3D2，即醇酸物质的量比1∶3，酶用量6%，反应温度50 ℃，反应时间48 h。通过验证试验，得到的大豆甾醇共轭亚油酸酯产率为98.94%。

表1 L9(34)正交因素与水平

表2 L9(34)正交试验结果

表3 方差分析

注：**表示P<0.01，差异极显著。

2.3 大豆甾醇共轭亚油酸酯的表征

大豆甾醇和纯化后的大豆甾醇共轭亚油酸酯红外光谱图分别见图7、图8。

图7 大豆甾醇的红外光谱图

图8 大豆甾醇共轭亚油酸酯的红外光谱图

3 结论

本研究采用脂肪酶催化法合成大豆甾醇共轭亚油酸酯，并通过正相高效液相色谱对产物进行定性定量分析。通过单因素试验和正交试验，得到大豆甾醇共轭亚油酸酯的最佳合成工艺条件：CRL脂肪酶的添加量为6%，醇酸物质的量比为1∶3，酯化反应温度为50 ℃，酯化反应时间为48 h，在此最佳条件下，大豆甾醇共轭亚油酸酯的产率为98.94%。