MicroRNA-7对HCCC9810细胞增殖、迁移和侵袭的研究

张家宁，孙大鹏，李雯，周伟平

(海军军医大学附属东方肝胆外科医院肝外三科，上海 200438)

在肝脏的原发性肿瘤中，肝内胆管癌的发病率仅次于肝细胞肝癌，而且由于肝内胆管癌的起病更为隐匿，进展迅速，相比于肝细胞肝癌，其5年生存率更差[1-2]。不仅仅是我国情况如此，在一些欧美国家肝内胆管癌的发病率也呈逐年上升的趋势[3]。近年来很多研究报道了MicroRNA-7 (miR-7)在多种肿瘤中低表达，如肺癌、乳腺癌以及胃癌等,而且MiR-7能够在不同的肿瘤中通过特定的机制影响癌细胞的增殖、迁移、侵袭等[4-6]。但是在肝内胆管癌中，miR-7是否也起着一定生物学作用尚未明确。基于此，本文通过体外实验探索了miR-7对于肝内胆管癌细胞HCCC9810的影响，以期为以后的临床转化提供实验基础。

材料与方法

一、材料准备以及临床样本选择

本研究使用的肝内胆管癌细胞HCCC9810以及正常人肝内胆管上皮细胞购于中国科学院上海细胞库；其他试剂和相关设备包括： RPMI1640培养基，OPTI-MEN培养基，胎牛血清 (FBS) ，lip3000 以及miRNA合成试剂盒Invitrogen(美国)； 6孔板12孔板以及96孔板(美国Corning)，CCK-8试剂盒(Dojindo)，EDU试剂盒(广州锐博生物)，Transwell 小室(美国Corning)；miR-7 mimics以及MIR-7 阴性对照以及内参引物均由上海生工公司提供。

所有用于实验检测的28例病人的组织样本均取自东方肝胆外科医院，病人术后的肝内胆管癌癌组织和癌旁组织均经过病理证实。手术取出样本后立即放在液氮中冷冻然后冻存于-80 ℃冰箱。病人所有样本的采集均经过病人的知情同意而且得到医院伦理委员会批准。

二、细胞培养及转染

将细胞用RPMI1640完全培养基(10%胎牛血清、1%青霉素以及链霉素)在37 ℃、5% CO2的温箱下进行培养。胆管癌细胞HCCC9810设立miR-7 mimics+lip3000(miR-7 mimics组) 以及miR-7 NC+lip3000(miR-7 NC组)。其miR-7 mimics序列为(CTGTAGAGGCATGGCCTGTGC)；miR-7 NC序列为(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)。

三、实时定量PCR

使用Trizol提取细胞或组织的总RNA，然后按照Takara公司的逆转录试剂盒获得cDNA，以cDNA为模板进行实时定量PCR实验。其中目的基因和内参的序列如下：miR-7上游引物(5′-CGTGCTGGAAGACTAGTGAT-3′),miR-7 下游引物 (5′-GAGCAGGGTCCGAGGT-3′);U6上游引物(5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′);U6下游引物(5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′)。

四、CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况

取各组细胞以3 000个/100 μl接种于96孔板，细胞周围每孔加入100 μl PBS以减少蒸发，待细胞贴壁后，分别取0、12、24、36、48、60 h六个时间点，每孔加入10 μl的CCK-8试剂后避光孵育2 h,而后通过酶标仪在450 nm的波长下测其吸光值。每组设立3个复孔，且每组实验重复3次。

五、EDU细胞增殖检测试验

取对数生长期的各组细胞按照5×104个/ml的密度接种在12孔板里，按照EDU试剂说明书的方法分别进行EDU标记、细胞固定、Apollo染色以及DNA染色，最后通过荧光显微镜获得图像。每组设立3个复孔，实验重复3次。

六、克隆形成实验

取对数生长期的各组细胞，常规洗涤、消化、离心，重悬细胞后，按照每孔600个细胞种植在六孔板里，加入足够完全培养基，待10 d后，镜下观察，待克隆的大小以及数量合适后，拍照并计数。每组设立3个复孔，实验重复3次。

七、划痕实验

为验证细胞的迁移能力是否发生了变化，将阴性对照组细胞以及miR-7 mimics研究组细胞分别接种到12孔板里，待到细胞快长满时，在细胞表面使用10 μl的小枪头在细胞表面进行划痕，然后将细胞培养基换成无血清培养基后放入细胞培养箱，待到48 h后，使用PBS洗去脱落的细胞，在显微镜下拍照观察，每个样品设置3个复孔，获得的划痕数据用于后续统计分析。

八、Transwell实验

为验证细胞的侵袭能力是否发生了变化，分别将不同组别的细胞进行常规消化计数，使用RPMI1640重悬细胞后，以2×105个/ml的细胞密度加入200 μl接种到铺好matrigel胶的Transwell小室的上室，同时下室加入800 μl的RPMI1640培养基(含有10%胎牛血清)，待到48 h后，使用4%的多聚甲醛进行细胞固定20 min,之后使用结晶紫进行细胞染色，最后进行拍照并细胞计数，每个样品设立3个平行复孔。

九、统计学分析

结 果

一、病人组织以及细胞中miR-7表达水平验证结果

定时定量PCR对于肝内胆管癌病人的癌组织和癌旁组织中miR-7的表达水平验证发现癌组织中miR-7的表达量明显低于癌旁组织(P<0.01)，见图1A；HCCC9810细胞中miR-7的表达量也低于正常肝内胆管上皮细胞HIBEC(P<0.01)，见图1B。

二、转染效率结果

在细胞转染后，我们通过定时定量PCR进行了验证，如图2所示，发现miR-7 mimics组miR-7的表达水平明显高于miR-7 NC组，且差异具有统计学意义(P<0.05)。

三、CCK-8增殖实验结果

CCK-8增殖实验如图3所示，通过不同时间点对于HCCC9810细胞增殖能力的检测，发现miR-7 mimics组其细胞增殖能力显著弱于miR-7 NC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

四、EDU实验结果

EDU实验中，我们也得到了类似CCK-8实验的效果。如图4所示，HCCC9810细胞中，miR-7 mimics组相比于miR-7 NC组，其阳性细胞显著减少(P<0.05)，提示细胞增殖能力下降。

五、克隆形成实验结果

克隆形成实验如图5所示，在HCCC9810细胞中，mimics组其细胞克隆形成能力显著弱于miR-7 NC组(P<0.001),mimics组肉眼下几乎不能发现形成的细胞克隆。

六、划痕实验结果

进一步对于细胞的迁移能力进行检测，发现miR-7 mimics组细胞的迁移能力要弱于miR-7 NC组(P<0.05),提示高表达miR-7后，可抑制胆管癌细胞的迁移。见图6。

七、Transwell实验结果

进一步探索miR-7过表达后，是否对癌细胞的侵袭能力产生影响，结果如图7，发现miR-7 mimics组穿过的细胞要明显少于miR-7 NC组的细胞数目(P<0.01)，证实了miR-7可以抑制癌细胞的侵袭能力。

讨 论

肝内胆管癌的发病率近年来逐渐攀升，由于肝内胆管癌早期临床表现并不明显，而且进展迅速，很多病人确诊时已经错过了手术时机，而对于非手术治疗，无论是化疗还是放疗，目前的治疗效果均不是很理想[7-8]。在其他肿瘤中，对于错过手术机会的病人，靶向治疗展示出了巨大的前景和疗效，而对于肝内胆管癌，目前仍缺乏一些特异性的分子靶点[9-10]。因此，有必要对于肝内胆管癌细胞的增殖、迁移、侵袭等过程进行探索，这对于肝内胆管癌的治疗以及控制疾病的发展提供了相关的分子治疗目标和靶点。研究发现，MicroRNA在细胞的生长发育过程中起着重要的调控作用，而且很多癌症的发生发展和MicroRNA的异常表达密切关联[11-12]。miR-7作为MicroRNA家族成员之一，在多种肿瘤中发现其异常表达可以影响癌细胞的生长、转移以及凋亡等。例如，在乳腺癌中，miR-7通过抑制ALDH1A3活性来抑制乳腺癌生长[13]；在直肠癌里，miR-7可以调控TRIP6以影响结直肠癌细胞的增殖和转移[14]；在胰腺癌中，miR-7可通过EGFR/STAT3途径影响癌细胞的增殖和转移[15]。但是在肝内胆管癌中，miR-7的表达水平以及是否可以发挥某些生物学功能较少报道，我们分别在组织水平以及细胞水平对于miR-7的表达水平进行了验证，组织中显示癌组织对比癌旁组织miR-7的表达水平下降，而细胞水平显示正常肝内胆管上皮细胞中miR-7的表达高于肝内胆管癌细胞HCCC9810，这些结果提示miR-7表达水平的失调可能会导致癌症事件的发生。我们在肝内胆管癌细胞系HCCC9810中过表达miR-7，体外实验的结果暗示miR-7在肝内胆管癌中可能扮演着抑癌基因的角色：即发现在肝内胆管癌细胞系中过表达miR-7后可以抑制癌细胞的增殖，转移以及侵袭。因此我们推测miR-7可能在肝内胆管癌的发生、发展过程中起到一定作用。

综上，过表达miR-7可以影响肝内胆管癌细胞的生物学行为，因此我们推测miR-7表达水平的异常可能会影响到肝内胆管癌的发展，从而最终影响到肝内胆管癌病人疾病的进展过程甚至生存预后。虽然目前缺乏一些证据证实miR-7是否可以作为临床上肝内胆管癌治疗的靶点进行干预，但是目前的结果显示miR-7具有进一步研究的价值，它有望成为一个潜在的分子靶点为以后肝内胆管癌病人提供治疗选择，从而达到控制疾病的进展甚至最终治愈疾病的目的。