仔猪大肠杆菌性腹泻病的病原分离鉴定

徐海生

（赤峰市动物卫生监督所 024000）

大肠杆菌（Escherichia coli）又称大肠埃希氏菌，是食品卫生安全评价中重要的指标菌，普遍存在于人和动物肠道内，对人和动物具有致病性，常引起严重的败血症和腹泻[1]。 仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的仔猪消化道传染病， 是一种条件性致病菌，在养猪生产中多因阴冷潮湿、保温不好、温差过大、转群换料导致仔猪发病和死亡，发病率和死亡率均较高。 在养猪生产中，由于抗生素的不规范和盲目使用，导致细菌耐药谱不断扩大［2］，给猪大肠杆菌病的治疗和控制带来困难，同时对人类健康及公共卫生安全构成严重威胁[3]。 为了解赤峰地区仔猪大肠杆菌流行情况， 本研究从赤峰地区3 个规模化猪场采集了发生腹泻的仔猪肠道内容物，对本地区流行的血清型进行了分析，旨在为该地区仔猪大肠杆菌病的预防及细菌耐药性研究提供参考。

1 实验材料及方法

1.1 材料

1.1.1 病料

赤峰市3 个规模化猪场收集仔猪腹泻肛门拭子，共99 个样本。

1.1.2 主要试剂及培养基

单价血清：“O”抗原单价血清（批号：20170201），产自宁波天润生物药业有限公司，革兰氏染色液，麦康凯琼脂，营养琼脂，营养肉汤，三糖铁培养基（TSI），糖发酵管，MR 试剂，VP 试剂，靛基质试剂。

1.1.2 实验动物

53 只清洁级BALB/c 小鼠（体重18～23g，雌雄各半）。购买自北京中医药大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养

将采集的99 只肛门拭子棉签放入2mL 无菌生理盐水中浸泡5min，取0.2mL 含有病原的生理盐水接种在5mL 营养肉汤培养基中，37℃培养24h，观察试管内菌液特征。 用接种环挑取浑浊菌液，接种在麦康凯琼脂平板上，37℃培养24～48h［4］，观察菌落特征。

1.2.2 分离菌染色镜检

观察麦康凯琼脂平板培养基菌落， 红色菌落为疑似大肠杆菌，用接种环挑取疑似菌落进行涂片，采用革兰氏染色，镜检观察菌体特征。 同时对疑似菌落进行纯培养。

1.2.3 生化实验

利用糖发酵试验（包括：葡萄糖C6H12O6、乳糖C12H22O11、麦芽糖C12H22O11·H2O 、鼠李糖C6H12O5、木糖C5H10O5、蔗糖C12H22O11、甘露醇C6H14O6、果糖C6H12O5、山梨糖醇C6H14O6和卫矛醇C6H14O6发酵试验）、尿素酶试验、橼酸盐利用试验、甲基红（MR）试验、VP 试验和吲哚试验对纯培养物进行鉴定和筛选，并记录相应的结果。

1.2.4 血清型鉴定

通过分离培养、染色镜检、生化试验后初步确诊的大肠埃希菌接种在普通营养琼脂斜面进行纯培养， 培养后用5g/L 的石炭酸生理盐水将菌苔洗下，制成菌悬液，菌悬液在121℃的环境高压处理2h，意在破坏大肠埃希菌的“K”抗原，待菌液冷却后，挑取一铂耳环菌液与已稀释5 倍的大肠埃希菌O 抗原单价血清在玻板上混匀，同时菌悬液与生理盐水混合物作对照，观察有无自凝集现象，若30s 内出现明显凝集者为阳性［5］。

1.2.5 小鼠致病性试验

将鉴定为大肠杆菌的细菌菌液用灭菌生理盐水稀释至2×106CFU/mL 后接种到营养液中培养24～48h，以供攻毒用。 试验组选择48 只清洁级BALB/c 小鼠每只分别腹腔内注射0.2mL 菌液；对照组选择5 只清洁级BALB/c 小鼠，每只分别在腹腔内注射0.2mL 的生理盐水，试验组和对照组接种后，观察72h，随时记录小鼠的变化情况。 小鼠死亡后立即对胸腹腔内实质性器官进行细菌学检查。

2 结果及分析

2.1 分离菌在鉴别培养基上的菌落特性

将收集到的病原菌接种到麦康凯琼脂平板上，99 份供试样品中有60 份在麦康凯琼脂平板上出现圆形、中等大小的红色菌落，表明这些菌落发酵乳糖，初步认定为疑似大肠埃希菌菌落。其余39 份显示为其他菌落或不存在典型菌落形成。

2.2 分离菌的染色镜检

取麦康凯培养基上红色菌落进行革兰氏染色，在油镜下观察到革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌（图1）。疑似60 株菌均为大肠埃希菌。

图1 分离菌的染色镜检（革兰氏染色）

2.3 生化实验

对60 株疑似大肠杆菌纯培养后进行生化试验， 结果表明（表1），5 株菌株不符合大肠杆菌生化特性，其余的55 株分离菌生化试验的特点明显：能分解葡萄糖C6H12O6、乳糖C12H22O11、麦芽糖C12H22O11·H2O、鼠李糖C6H12O5、木糖C5H10O5、蔗糖C12H22O11、甘 露 醇C6H14O6、 果 糖C6H12O5、 山 梨 糖 醇C6H14O6和 卫 矛 醇C6H14O6，尿素酶试验阴性，枸橼酸盐利用率试验阴性，MR 试验阳性，V-P 试验阴性，吲哚试验阳性。 初步得出分离的60 株细菌有55 株为大肠杆菌。

2.4 血清型鉴定

对55 株大肠埃希菌采用O 抗原单价血清进行血清型鉴定。结果表明（表2），48 株大肠埃希菌血清型实验阳性，分布在7个血清型中，其中优势血清型为O8（21 株），其他血清型包括O20（3 株），O45（3 株），O60（5 株），O139（5 株），O141（3 株），O149（8 株）。

表1 分离菌生化试验结果

表2 大肠埃希菌血清型鉴定结果

2.5 小鼠致病性试验

对实验小鼠的发病情况和临床症状进行观察和统计得出48 株分离细菌可引起小鼠出现活动性降低、采食量减少、全身间歇性颤抖等症状。 在攻毒48h 内有24 株分离菌使小鼠死亡，发现血清型为O8的有18 株，O141的有3 株，O149的有3 株。 对死亡的小鼠进行解剖， 分别取其心脏血在麦康凯琼脂平板上划线分离培养，37℃培养24h，均得到了疑似大肠埃希菌，挑取疑似菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察到革兰氏阴性的、两端钝圆的短小杆菌。而对照组的5 只小鼠全部健康。分离株对小鼠的致病性试验结果见表3。

3 讨论

表3 各血清型大肠埃希菌致病性试验结果

本实验的方法是用腹泻仔猪的肛门棉拭子进行取样， 对大肠杆菌进行分离和鉴定，为防止因细菌含量低而造成检测困难，实验先进行营养肉汤的前增菌，再进行分离划线，这样保证接种平板时获得较好地分离效果。 生化反应是鉴定大肠杆菌的经典方法，99 份样品中有48 分鉴定为大肠杆菌， 进一步通过血清学鉴定血型后， 培养菌悬液接种小鼠， 试验组小鼠出现活动性降低、采食量减少、全身间歇性颤抖等临床症状，在攻毒48h 内有24 株分离菌使小鼠死亡，对照组小鼠运动和饮食均正常，细菌学检验结果显示，在麦康凯培养基上，分离于猪和小鼠的菌株均呈玫红色圆形菌落； 革兰氏染色后菌体形态为两端钝圆的革兰氏阴性杆菌。 综合上述结果，最终确定松山区仔猪腹泻大部分是由致病性大肠埃希菌所致，分离的48 株大肠杆菌菌株其中O8血清型有21 株，为优势血清型，O20血清型有3 株，O45血清型有3 株，O60血清型有5 株，O139血清型有5 株，O141血清型有3 株，O149血清型有8 株。 初步确定了赤峰地区猪场中大肠埃希菌的主要菌株的血清型，O8血清型是引起本地区仔猪腹泻的最主要血清型菌株，O149次之， 这对本地区仔猪大肠杆菌病的防治具有重要意义。