遗传性球形红细胞增多症ANK1基因新发突变①——2例病例报道及文献复习

王彩丽 张景荣 (贵阳市妇幼保健院血液科，贵阳 550003)

遗传性球形红细胞增多症(hereditary spherocytosis，HS)是一种常见的遗传性溶血性贫血，临床主要表现为贫血、黄疸、脾大，外周血涂片球形红细胞增多。HS是先天性红细胞膜蛋白基因突变，引起红细胞球形化，在脾脏破坏增加引起溶血性贫血。目前已发现5种红细胞膜蛋白编码基因与HS发病相关，即ANK1、SPTB、SLC4A1、EPB42和SPTA1基因上，分别编码锚蛋白、β血影蛋白、带3蛋白、4.2蛋白和α血影蛋白。其中以ANK1基因突变最常见[1]。贵阳市妇幼保健院儿童医院血液科诊断2例ANK1基因突变HS 患儿，经家系分析为自发突变，未被HGMD数据库收录，无文献报道，为新发突变，报道如下。

1 临床资料

例1：男，5岁11个月。汉族，贵州籍。因“反复面色苍黄2年余，发热、咳嗽2天”入院，2年来，多次在感染或劳累时出现面色苍黄，有时伴尿色加深。曾就诊当地医院，诊断自身免疫性溶血性贫血，泼尼松治疗6月。本次呼吸道感染期间，面色苍黄加重入院。新生儿期曾因高胆红素血症蓝光治疗。父母体健，否认贫血、黄疸病史。

入院查体：生命体征平稳，发育正常，营养中等。皮肤、巩膜轻度黄染，心肺无异常，肝脏右肋下3 cm可及，质地稍韧，脾脏左肋下4.5 cm可及，质地韧，无触痛。甲床苍白，神经系统无异常。

辅助检查：血常规：白细胞7.21×109L-1，红细胞2.55×1012L-1，血红蛋白67 g/L，血小板243×109L-1，网织红细胞13%，平均红细胞体积84.7 fl，平均红细胞血红蛋白含量26.3 pg，平均红细胞血红蛋白浓度310 g/L。血生化：总胆红素37.42 μmol/L(正常参考值：0～17.1)，直接胆红素15.47 μmol/L(正常参考值：0～3.4)，间接胆红素21.95 μmol/L(正常参考值：0～13.7)。Coombs(IgG+C3d)直接及间接实验均阴性，M-Hb还原率90%。红细胞渗透脆性：开始溶血4.8 g/L(对照为4.8 g/L)，完全溶血2.8 g/L(对照为2.8 g/L)。血红蛋白电泳：未见异常。血清铁蛋白：87 ng/ml。末梢血涂片：球形红细胞3%。

基因检查：家属知情同意后，取患儿及父母外周静脉血2 ml，提取DNA。送北京迈基诺医学检验所，以二代高通量测序技术对208个已知的红细胞系统候选基因进行测序分析，经过分析筛选得到的获选变异位点利用PCR和Sanger测序验证。PCR引物对利用Primer 3.0 在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计。PCR产物经过Sanger测序并在ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)上进行分析。检测发现ANK1基因有一剪切突变(NM_001142446;exon9)c.1008+1_1008+2insG(splicing)(图1)。患儿父母未发现该位点变异(图2)。

例2：男，3岁11个月。汉族，贵州籍。因“反复面色苍黄1年余，加重5天”入院，1年来，多次在感染时出现面色苍黄，有时伴尿色加深。曾输血治疗。本次无明显诱因面色苍黄加重入院。新生儿期曾因高胆红素血症蓝光治疗。父母体健，否认贫血、黄疸病史。

入院查体：生命体征平稳，发育、营养中等。皮肤、巩膜轻度黄染，心肺无异常，肝脏右肋下2.5 cm可及，质地稍韧，脾脏左肋下4.0 cm可及，质地韧，无触痛。甲床苍白，神经系统无异常。

辅助检查：血常规：白细胞5.2×109L-1，红细胞2.50×1012L-1，血红蛋白73 g/L，血小板230×109L-1，网织红细胞11.5% ，平均红细胞体积92.2 fl，平均红细胞血红蛋白含量29.4 pg，平均红细胞血红蛋白浓度318 g/L。血生化：总胆红素65. 85 μmol/L(正常参考值：0～17.1)，直接胆红素11.12 μmol/L(正常参考值：0～3.4)，间接胆红素54.73 μmol/L(正常参考值：0～13.7)。Coombs(IgG+C3d)直接及间接实验均阴性，M-Hb还原率90%。红细胞渗透脆性：开始溶血5.6 g/L(对照为4.8 g/L)，完全溶血3.6 g/L(对照为2.8 g/L)。血红蛋白电泳：未见异常。末梢血涂片：球形红细胞10%。

图1 患儿ANK1 c.1008+1_1008+2ins Gsanger测序图Fig.1 ANK1 c.1008+1_1008+2ins Gsanger sequencing map of patient

图3 患儿ANK1 c.940 C>T sanger测序图(反向互补测序)Fig.3 ANK1 c.940 C>T sanger sequencing map of patient(reverse complementary sequencing)

图4 患儿父母ANK1 c.940C sanger测序图(反向互补测序)Fig.4 ANK1 c.940C sanger sequencing map of patient′s parents(reverse complementary sequencing)Note:A:Father;B.mother.

基因检查：检测发现ANK1基因有一无义突变 (NM_001142446;exon9) c.940C>T (p.R314X)，患儿父母该位点为野生型(图4)。

ANK1的杂合突变可能导致常染色体显性遗传的Ⅰ型HS，根据美国医学遗传学与基因组学会(ACMG)指南，本资料中2例变异初步判定为致病性变异。结合患儿病史，符合HS诊断。

2 文献检索结果

以“遗传性球形红细胞增多症”和“ANK1基因”为关键词检索中国知网，共纳入文献15篇，涉及ANK1基因突变导致遗传性球形红细胞增多症7篇，10个位点，其中2个为新报道位点。以“遗传性球形红细胞增多症”、“ANK1基因”和“c.1008+1_1008+2insG(splicing)”为关键词检索中国知网、万方数据库中文文献数据库，未发现相关报道。以“遗传性球形红细胞增多症”、“ANK1基因”和“c.940C>T (p.R314X)”为关键词检索中国知网、万方数据库中文文献数据库，未发现相关报道。

以“hereditary spherocytosis”、“ANK1”为关键词检索PubMed数据库，纳入文献46篇，涉及ANK1基因突变导致HS 5篇，39个新报道位点。以“hereditary spherocytosis”、“ANK1”和“c.1008+1_1008+2insG(splicing)”为关键词检索PubMed数据库，未见相关报道。以“hereditary spherocytosis”、“ANK1”和“c.940C>T (p.R314X)”为关键词检索PubMed数据库，未见相关报道。检索人类基因突变数据库(HGMD)专业版数据库，ANK1基因突变位点111个，未见“c.1008+1_1008+2insG(splicing)”及“c.940C>T (p.R314X)”2个突变位点收录。

3 讨论

本资料2例患儿临床均表现为溶血性贫血，一例因缺乏实验室依据，造成长期误诊。另一例发现红细胞脆性增加、球形红细胞增多诊断HS。2例均无阳性家族史。通过基因检查，2例患儿ANK1基因均发现杂合突变，父母无该位点变异，为自发突变。根据美国医学遗传学与基因组学会(ACMG)指南，该变异为致病性变异。检索人类基因突变数据库(HGMD)及文献，无该位点报道，为新发突变。

HS是常见的先天性溶血性贫血之一，不同种族、不同人群之间发病率、临床表现及基因突变存在差异。HS在北欧、北美国家常见，发病率1/5 000～1/2 000[2]，我国南部和东部报道多，西藏、青海、贵州只有少数报道[3]。HS典型临床症状有贫血、黄疸、脾大，实验室检查有球形红细胞增多、网织红细胞增多、MCHC增高，欧美遗传性球形红细胞增多症诊疗指南中指出，有HS家族史、典型临床症状、实验室检查即可诊断[4]。但非高发地区自发突变常见，缺乏阳性家族史。且传统检测手段敏感性、特异性有限，易造成误诊、漏诊。基因检查可协助诊断，提高诊断率。

HS分子发病机制是基因突变导致红细胞膜蛋白缺陷。红细胞膜蛋白是红细胞膜与细胞骨架间的垂直连接装置，对维护红细胞膜完整性及红细胞的形状起非常重要的作用。红细胞膜或细胞骨架的组成蛋白的突变，引起红细胞膜的丢失，进而出现红细胞膜表面积减少，使红细胞的外形由双凹圆盘状变为小球形，球形红细胞变形性小，经过脾脏时滞留于脾窦，被脾脏破坏增加，红细胞寿命缩短，出现溶血性贫血表现。不同种族和地区，HS致病基因和膜蛋白缺陷类型存在差异，了解本地区HS基因突变类型，对HS的诊断、治疗、预防有重要作用。欧美人群最常见的是ANK1基因突变，约占HS半数。我国HS患者常见的突变基因为ANK1和SPTB，主要表现为错义突变和无义突变。HS相关基因突变与严重程度之间无显著相关性[5]。

ANK1基因定位于8号染色体P11.2，有42个外显子，编码锚蛋白，是红细胞膜蛋白成分之一，对红细胞膜稳定性起关键作用[6]。ANK1突变主要为常染色体显性遗传，约占60%，最常见类型有无义突变、移码突变和剪接突变。在隐性遗传的患者中，ANK1突变类型常见的为启动子突变和错义突变。

查阅文献发现，新生ANK1突变发生频率高，已报道的ANK1新生突变主要为移码突变和无义突变。多数散发病例中，大量新生突变出现在母体生殖细胞中，患者父母临床表现、血液学检查正常[7-11]。到目前为止，人类基因突变数据库(HGMD)专业版数据库收录的ANK1突变有111种，相关疾病为球形红细胞增多症、HS、溶血性贫血。

基因诊断技术的广泛应用，使一些散发的、自发突变的、临床症状不典型的HS得到及时诊断。同时，发现了许多新的突变，了解疾病的基因突变类型，对于疾病的诊断和产前预防有重要意义。