不同遗传背景对C5aR在银屑病病理中作用的影响①

徐 砜 郑权友 李桂清 陈 戬 许桂莲 (陆军军医大学基础医学院免疫学教研室,重庆 400038)

银屑病是一类慢性反复发作的皮肤炎症性疾病，大多在40岁以下发病，其流行性分布随着地理区域的分布及人种类别的差异而有所不同[1]。在银屑病的发病机制中，目前认为是免疫细胞与上皮细胞相互作用的结果[2]。其中，最为重要的是IL-23/IL-17通路产生的IL-17，IL-17作用于角质形成细胞产生银屑病相关分子从而导致该病的发生发展[3,4]。多种类型的免疫细胞可分泌IL-17，且最近研究发现，分泌IL-17γδT细胞亚群与Th17亚群有近乎相同作用，在银屑病中它们也被统称为“T17”[5,6]。因此，分泌IL-17的γδT细胞的频率也可作为银屑病疾病程度的监测指标之一[7,8]。

Greb等[1]报道了在世界上不同地区人群中银屑病的发病率存在差异，即银屑病的发生与遗传因素相关。人类皮肤和小鼠皮肤在结构上非常相似，小鼠的皮肤下有环状的毛囊、表皮更新较快，皮肤中有γδT淋巴细胞的存在，采用小鼠来模拟人的皮肤病模型已经很成功地被应用在银屑病的研究当中[9,10]。同时，实验发现C5aR基因敲除后，咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎明显减轻(SCI论著在投中)，但未比较不同遗传背景下C5aR在银屑病病理发生中的作用。本研究通过咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型，比较了C5aR+/+BALB/c、C5aR-/-BALB/c、C5aR+/+C57BL/6和C5aR-/-C57BL/6 4组小鼠病情的严重程度，探讨了C5aR基因缺陷在不同遗传背景下对咪喹莫特诱导的银屑病病情的影响。

1 材料与方法

1.1材料 雌性8～12周龄SPF(specific-pathogen-free)级C57BL/6以及BALB/c小鼠均购自北京华阜康生物科技有限公司；C5aR-/-BALB/C小鼠[C.129S4(B6)-C5ar1tm1Cge/J]购自JACKSON实验室；C5aR-/-C57BL/6小鼠为本实验室构建(C5aR-/-BALB/c小鼠和C5aR+/+C57BL/6小鼠杂交，然后将所得杂合子C5aR+/-再与C5aR+/+C57BL/6小鼠回交连续12代以上，再将杂合子C5aR+/-自交，筛选出C5aR-/-子代，即C5aR-/-C57BL/6小鼠)。所有实验小鼠均饲养于陆军军医大学免疫学研究所SPF级层流动物房，自由饮食饮水至合适周龄，备用。TRIzol试剂盒、递转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；RPMI1640培养基购自Hyclone公司；Ⅳ型胶原酶、Ionomycin、Invitrogen购自Sigma公司；荧光标记抗体购自Ebioscience公司；流式细胞仪购自BD FACS CantoⅡ公司。

1.2方法

1.2.1小鼠分组及银屑病模型的建立 小鼠分为4组：C5aR+/+BALB/c (5只/组)、C5aR-/-BALB/c(4只/组)、C5aR+/+C57BL/6(5只/组)和C5aR-/-C57BL/6(4只/组)小鼠组。4组小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠后，剃刀刮除右侧背部皮肤被毛，形成约3 cm×2 cm的裸露皮肤区域。剔除被毛24 h 后在小鼠背部皮肤裸露区涂抹等量 (60 mg/d) 的咪喹莫特乳膏 (四川明欣利迪药业有限公司)，连续给药5 d，最后一次给药24 h后处死小鼠并取材。

1.2.2小鼠银屑病样皮损的评价 按照PASI标准，于每日给药前观察小鼠背部皮肤裸露区并评分，根据皮损处红斑(erythema，E)、浸润(infiltration，I)、鳞屑(scales，S)三项指标由轻至重按照0～4分的标准进行评分并相加得到总分。绘制随时间变化的评分曲线。

1.2.3小鼠皮损局部组织HE染色 小鼠断颈处死后，于背部皮损局部随机取2块皮肤组织，经4 %多聚甲醛固定后，行脱水、石蜡包埋、切片处理，按照HE染色的操作步骤进行染色。每个样本随机选取两张切片进行HE染色，每张切片随机选取3个视野进行拍照，对表皮棘层的增生层数进行分析。

1.2.4荧光定量PCR 利用TRIzol试剂盒提取小鼠诱导银屑病后皮损组织中的总RNA，以逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA后，应用荧光定量PCR试剂盒进行扩增，检测小鼠诱导银屑病后皮损组织中IL-17的表达。引物序列如下：β-actin上游引物：5′-ATGACCCAAGCCGAGAAGG-3′，下游引物：5′-CGGCCAAGTCTTAGAGTTGTTG-3′；IL-17上游引物：5′-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3′，下游引物：5′-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3′。

1.2.5流式细胞仪检测小鼠皮肤局部组织IL-17A+γδT细胞亚群的浸润 小鼠断颈处死后，取1 cm×1 cm 皮肤组织置于1.5 ml EP管中，充分剪碎至匀浆，加入2.5 mg/ml的Ⅳ型胶原酶后于37℃摇床消化1.5 h，过滤，1 800 r/min离心后以1 ml RPMI1640 培养基重悬细胞，加入PMA(10 ng/ml)和Ionomycin(250 ng/ml)和BFA(Invitrogen 1 000×)1 μl，于CO2孵箱培养4 h。收集细胞后，加入抗CD3、γδTCR和IL-17A的荧光标记抗体，流式细胞仪检测目的亚群百分比。细胞因子的刺激和胞内阻滞以及染色的具体方法见文献[11、12]。

1.2.6流式细胞仪检测小鼠引流淋巴结中IL-17A+γδT细胞亚群的百分比 小鼠断颈处死后，剪开腋下皮肤暴露皮下淋巴结，取出淋巴结后置于70 μm筛网 (Falcon) 上轻柔研磨，并加入PBS缓冲液冲洗，离心后用RPMI1640 培养基重悬细胞,同上述方法加入PMA、Inomycin和BFA刺激胞内因子的分泌并阻滞在胞内,流式细胞仪检测目标亚群的百分率。

2 结果

2.1与相应BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠银屑病样皮炎表型减轻 图1A显示在使用咪喹莫特乳膏连续5 d涂抹于4组小鼠背部皮肤后，诱导出严重程度不同的银屑病样皮炎表型。在相同遗传背景下，与C5aR+/+小鼠相比，C5aR-/-小鼠的皮损情况均有所减轻；在不同遗传背景下，C5aR+/+和C5aR-/-C57BL/6小鼠较相应BALB/c小鼠皮损情况减轻 (图1A)。图1B显示依据PASI评分标准，在咪喹莫特给药1 d后开始，根据4组小鼠背部皮肤红斑、鳞屑、浸润的严重程度进行评分后累加并记录，绘制随天数增加的评分曲线图，比较4组小鼠皮损的总体差异。在相同遗传背景下，C5aR-/-小鼠的PSAI评分均较C5aR+/+小鼠低(P<0.05)；不同遗传背景条件下,C57BL/6背景的C5aR+/+和C5aR-/-小鼠较BALB/c背景的相应小鼠PASI评分均显著降低(图1B，P<0.05)。与BALB/c小鼠相比，C57BL/6遗传背景的C5aR+/+小鼠和C5aR-/-小鼠咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎显著减轻。

2.2与相应BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠银屑病样皮炎的表皮组织较薄、 表皮增生程度较轻 图2A为BALB/c和C57BL/6小鼠皮肤组织的HE染色结果，图2B为经Image J软件测量小鼠炎症表皮厚度的结果。从4组小鼠皮肤组织的HE染色及皮肤表皮组织的半定量分析结果可以发现：4组小鼠在咪喹莫特干预后，表皮棘层有不同程度的增厚。在不同遗传背景下，与相应BALB/c小鼠相比，C57BL/6背景的C5aR+/+小鼠与C5aR-/-小鼠表皮棘层增厚程度均较轻(图2)。

图1 不同遗传背景(BALB/c 和 C57BL/6)小鼠对咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎敏感性的比较Fig.1 Comparison of IMQ-induced psoriasis skin infla-mmation in BALB/c and C57BL/6 backgro-und miceNote: A.The BALB/c strain mice and C57BL/6 strain mice back psoriasis-like skin inflammation induced by IMQ for 5 days；B.The PASI scores of four groups mice.C5aR+/+ mice，n=5;C5aR-/-mice，n=4，*.P<0.05.

图2 银屑病样皮炎小鼠背部皮肤组织的HE染色Fig.2 HE staining of back skin lesion sections in mice with psoriatic-like skin inflammationNote: A.HE staining of psoriatic-like skin inflammation sections on day 5(×100)；B.The epidermis thickness of psoriasis-like skin mice,n=5;C5aR-/- mice,n=4，*.P<0.05.

图3 银屑病样皮炎小鼠背部皮肤组织中IL-17A mRNA的表达水平Fig.3 mRNA levels of IL-17A in back skin lesion sections in mice with psoriasis-like skin inflammationNote: A.The IL-17 mRNA levels in back skin tissues were compared between C5aR+/+ and C5aR-/-mice with both BALB/c and C57BL/6 background；B.The IL-17 mRNA levels in back skin tissues were compared between BALB/c and C57BL/6 mice.C5aR+/+ mice,n=5;C5aR-/-mice,n=4.The values were presented as 1.

图4 流式细胞仪分析银屑样皮炎小鼠背部皮损局部和引流淋巴结中IL-17A+γδT细胞的百分率Fig.4 Percentage of IL-17A+γδT cells in back skin lesion tissues and draining lymphnodes in mice with psoriasis-like skin inflammation by FACSNote: A-C.Percentages of IL-17A+γδT cells in back skin lesions tissues of C5aR+/+ and C5aR-/- mice；D-F.Percentages of IL-17A+γδT cells in draining lymphnodes of C5aR+/+ and C5aR-/-mice.C5aR+/+ mice，n=5;C5aR-/-mice，n=4.The values were presented as

2.3与相应BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠银屑病样皮损局部IL-17 mRNA水平减少 Teunissen等[3]报道银屑病皮肤组织中IL-17 mRNA水平是反映疾病严重程度的指标之一。为了进一步验证4组小鼠皮肤组织中IL-17 mRNA的表达情况，我们提取了4组小鼠诱导银屑病后的皮肤组织的总RNA，通过qRT-PCR检测皮肤局部的IL-17 mRNA的表达情况。如图3A所示，在相同遗传背景下，C5aR-/-小鼠皮肤局部的IL-17 mRNA的相对表达量均低于C5aR+/+小鼠(BALB/c小鼠：P<0.05；C57BL/6小鼠：P<0.05)。如图3B所示，在不同遗传背景下，与BALB/c小鼠相比，C57BL/6 小鼠皮肤组织中IL-17 mRNA的表达显著减少(C5aR+/+小鼠：P<0.000 1； C5aR-/-小鼠：P<0.000 1)。

2.4与相应BALB/c小鼠相比，C5aR+/+或C5aR-/-C57BL/6小鼠皮损局部组织和引流淋巴结中γδT细胞百分比显著降低 将4组小鼠诱导银屑病后的皮肤组织消化收集细胞悬液、染色、流式细胞仪检测γδT细胞的百分率。结果如图4A所示，在4组小鼠皮肤组织中的IL-17A+T淋巴细胞中，γδT细胞所占比例有所不同。在不同遗传背景下(图4B)，C57BL/6小鼠的IL-17A+γδT细胞百分率较BALB/c 小鼠显著减少(C5aR+/+小鼠：39.68% 65.52%，P<0.05；C5aR-/-小鼠：24.55% 53.23%，P<0.05)；在相同遗传背景下(图4C)，C5aR-/-小鼠IL-17A+的γδT细胞百分率较同背景的C5aR+/+小鼠显著减少(BALB/c 背景：53.23%、65.52%，P<0.05；C57BL/6背景：24.55%、39.68%,P<0.05)。同时，将4组小鼠诱导银屑病后的右侧腋窝淋巴结取样，经研磨、染色后流式细胞仪检测，得到类似的结果(图4D～F)，即4组小鼠的IL-17A+γδT细胞亚群百分率的变化与背部皮损组织浸润的IL-17A+γδT细胞趋势一致。

3 讨论

银屑病被认为是一类与自身免疫系统失调相关的自身免疫性疾病。目前的研究认为，分泌IL-17的γδT细胞为该病发挥效应的主要细胞类型[13]。

Giacomassi等[14]揭示了补体系统在小鼠银屑病模型中的重要作用。本实验室前期研究发现，C5aR基因缺陷小鼠可显著衰减咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎(未发表结果，投稿中)。虽然有报道较之于C57BL/6小鼠，BABL/c背景的小鼠更易产生炎症较重而且鳞屑较多的皮炎表型，但并未对其进行分子或细胞学方面的对比[15]。本研究为进一步研究小鼠遗传背景对该病动物模型的影响，比较了C5aR+/+BALB/c、C5aR-/-BALB/c、C5aR+/+C57BL/6和 C5aR-/-C57BL/6 4组小鼠对咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎的敏感性。结果观察到，4组小鼠均成功诱导银屑病样皮炎，但不论是C5aR+/+或 C5aR-/-小鼠，C57BL/6背景的小鼠均比BALB/c背景小鼠表型较轻；皮炎组织的病理切片也提示上述同样的结果。该结果进一步证实了Giacomassi等[14]的研究报道，补体系统的确在银屑病的发病中起到十分重要的作用，且遗传背景会影响小鼠对银屑病炎症反应的敏感性。

Han等[16]研究证实C5aR在脓毒血症中对γδT细胞具有调节性作用，我们的结果也显示，在皮肤组织局部浸润的淋巴细胞中，相同遗传背景下，C5aR-/-小鼠均比C5aR+/+小鼠的皮肤组织局部IL-17A+γδT细胞的比例显著降低。而且基因表型相同，遗传背景不同的条件下，C57BL/6小鼠的皮肤组织局部γδT细胞比例均较低，同时相应皮肤组织局部的IL-17mRNA相对表达量也较低。在C57BL/6小鼠中，γδT细胞的比例较少，从而导致IL-17分泌较少，对表皮角质形成细胞的刺激较轻，因此炎症程度较轻。

综上所述，本研究结果表明：不同遗传背景的小鼠对于咪喹莫特诱导的银屑病样皮炎的敏感性不同，与相应BALB/c小鼠相比，C5aR-/-和C5aR+/+C57BL/6小鼠敏感性均相对较低，且BALB/c背景的小鼠更容易也更适合建立银屑病动物模型，这一研究为银屑病动物模型的建立提供了指导意义。