绿豆蛋白降血脂水解物的制备及纯化工艺

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(1.天津商业大学生物技术与食品科学学院,天津 300134; 2.天津中医药大学中药学院,天津 301617)

绿豆原产于中国,又名青小豆、植豆,富含蛋白质、淀粉、各种维生素及矿物质,其中蛋白质的含量为22%～26%[1],是小麦、小米和大米的2～3倍。此外,绿豆中赖氨酸含量是禾谷类的2～5倍[2]。近年来,针对绿豆的研究逐渐从绿豆淀粉和多糖转移到绿豆蛋白及其蛋白水解肽上[3],已有研究表明绿豆蛋白及其水解肽具有抗氧化、降血压、免疫调节等多种生理功效[4]。马诗文等[5]用复合酶协同水解法制备绿豆抗氧化活性多肽,得到的多肽具有良好的抗氧化活性;Xie等[6]研究了不同分子量绿豆蛋白水解物的抗氧化活性和对血管紧张素-I转化酶(ACE)的抑制作用,结果显示分子量小于3 kDa的部分具有较好的抗氧化活性和对ACE更好的抑制作用;Diao等[7]发现绿豆蛋白水解物对促炎因子有较强的抑制作用,从而减弱炎症反应,起到免疫调节作用。

高血脂症是由于体内脂质代谢或者转运异常导致的一种慢性疾病,主要指标是体内甘油三酯或者胆固醇水平高于正常值[8]。血脂水平与冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的形成密切相关,已经成为现代社会的高发病率之一的疾病[9-11]。传统降血脂药物往往具有一定副作用,例如他汀类药物对肝肾功能会造成一定的损伤,还会引起横纹肌溶解症等[12];而作为需要长期服用的降血脂类药物,价格昂贵也是限制其发展的一个重要原因,因此寻找合适有效的药品替代物成为当前研究热点[13]。目前已有研究证实绿豆具有降血脂的作用,Ruvini等用生绿豆、煮熟的绿豆和发芽的绿豆分别喂食高胆固醇大鼠,发现煮熟和发芽的绿豆均可使高胆固醇大鼠血清中非高密度脂蛋白胆固醇浓度降低和高密度脂蛋白胆固醇浓度增加[14];Swee等研究发现发酵绿豆在高胆固醇小鼠体内有抗氧化和降血脂的作用[15];王沛发现绿豆水醇提取物对高脂血症家兔有良好的降血脂效果[16]。胆汁酸是人体中含量丰富的一种固醇物质,包括初级胆汁酸(如胆酸)和次级胆汁酸(如脱氧胆酸),一般以盐的形式存在,其在脂肪和胆固醇合成中起到重要作用。目前关于绿豆蛋白水解物的降血脂作用的研究还鲜有报道,因此以与胆酸盐结合能力为出发点,研究绿豆蛋白水解物体外降血脂的作用。

本文采用酶水解的方法,以水解物对胆酸盐的络合能力为考察指标,在单因素实验的基础上,使用Box-Behnken响应面设计进行水解工艺优化,并进行超滤纯化得到绿豆蛋白降血脂水解物,筛选出降血脂作用较强的水解部分,为进一步开发利用绿豆蛋白提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆 津早绿一号绿豆,采购于天津市静海区;考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白 天津德思化学试剂有限公司;浓硫酸 分析纯,永飞化学试剂有限公司;中性蛋白酶(100 U/mg)、碱性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、胰蛋白酶(250 USPu/mg)、复合蛋白酶(120 U/mg)、脱氧胆酸钠(>98%)、胆酸钠(>98%)、牛磺胆酸钠(>98%) 源叶生物科技有限公司;8×USP猪胰酶 生工生物工程有限公司;其他试剂 购于天津市化学试剂供销公司;所有试剂 均为国产级分析纯；实验用水 均为去离子水。

DH-101电热恒温鼓风干燥箱 天津市中环实验电炉有限公司;FW100型高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;ME204型电子天平 梅特勒托利多(上海)有限公司;TDA-8002型恒温水浴锅 天津市中环实验电炉有限公司;KQ-500B型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Heraeus Megafuge 8R型离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;多功能读板机 美国Molecular Devices SpectraMax-M5;pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;ALPHA1-4LD真空冷冻干燥机 德国Marin Christ;超滤管 Sartorius;AKTA Start蛋白质层析系统 美国GE;Sephacryl S-100 High Resolution凝胶层析柱(长600 mm,直径26 mm,填料粒径为47 μm) GE Healthcare;SHZ-CD型循环式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理制备 绿豆洗净烘干,用粉碎机磨成粉,过80目筛储存备用。按照1∶15的料液比在绿豆粉里加入PBS缓冲液(pH=10.0),40 ℃超声辅助提取8 min。将提取液离心(4 ℃,500 r/min,20 min),取上清液,用0.05 mol/L HCl溶液调节其pH=4.6,搅拌使沉淀均匀。随后离心(4 ℃,500 r/min,15 min)弃上清,经冷冻干燥后得绿豆粗蛋白[17]。

1.2.2 理化指标的测定 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[18]。多糖含量的测定采用苯酚硫酸法[19]。

1.2.3 蛋白酶的筛选 采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶5种蛋白酶分别水解绿豆蛋白。控制底物浓度为1 g/100 mL,加酶量10000 U/g,在5种酶的最适pH和最适温度下水解120 min。随后,100 ℃水浴加热5 min灭酶,将各水解液离心(5000 r/min,10 min)取上清液冻干后储存备用。将冻干的水解物配制成1 g/100 mL,以水解物对胆酸盐的吸附能力为考察指标,筛选出制备水解物的最佳蛋白酶。

1.2.4 胆酸盐吸附实验 胆酸盐标准曲线的测定[20]:配制0.4 mmol/L的胆酸钠、脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠标准液备用。分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL标准液于50 mL带盖玻璃瓶中,用0.1 mol/L的PBS补充至2.5 mL。然后加入7.5 mL 60%的硫酸溶液,于70 ℃水浴加热反应50 min后冰浴5 min。分别对同浓度的3种胆酸盐进行全波长扫描(200～1000 nm)得到其最大吸收波长。在最大波长处测定反应后溶液的OD值,计算得到3种胆酸盐标准曲线方程。

人工胃液的制备:取1 mol/L盐酸16.4 mL,加入800 mL纯水,再加入10 g胃蛋白酶,摇匀溶解后加水定容至1000 mL。

人工肠液的制备:准确称取磷酸二氢钾6.8 g,溶解于500 mL纯水中,用0.4%的NaOH溶液将pH调制6.8,加入猪胰酶5 g溶解后定容至1000 mL。

绿豆蛋白水解产物对胆酸盐络合能力的测定[21]:分别取不同条件下的水解产物1 mL(1 g/100 mL),加入1 mL人工胃液,在37 ℃水浴锅中恒温水浴60 min。随后,加入5 mL人工肠液模拟肠环境,加入4 mL 0.02 mmol/L的胆酸盐溶液继续37 ℃恒温水浴60 min。底物空白组用0.1 mol/L的PBS代替胆酸盐。胆酸盐空白组只加入4 mL 0.02 mmol/L的胆酸盐溶液,其他用0.1 mol/L的PBS代替。反应结束后将样品倒入离心管,8500 r/min离心15 min后取上清液2.5 mL,加入7.5 mL 60%的硫酸溶液,于70 ℃水浴加热反应50 min后冰浴5 min。冷却后在胆酸盐最大波长处测定吸光值,由标准曲线求得上清液中胆酸盐的浓度。并按下述公式进行计算:

式中:W为胆酸盐结合率,%;C0为胆酸盐空白组的浓度,mmol/L;C1为上清液中胆酸盐的浓度,mmol/L。

1.2.5 单因素实验设计 选取水解时间(min)、加酶量(U/g)、底物浓度(g/100 mL)、水解温度(℃)作为考察因素,设计单因素实验。每个因素设置5个水平的实验,以水解物与脱氧胆酸钠结合率为指标分别对这四个因素的影响进行分析。

1.2.5.1 水解时间对水解物结合脱氧胆酸钠能力的影响 控制加酶量为10000 U/g,底物浓度为1 g/100 mL,水解温度固定为45 ℃,考察水解时间分别为60、90、120、150和180 min时水解物结合脱氧胆酸钠的能力。

1.2.5.2 加酶量对水解物结合脱氧胆酸钠能力的影响 控制水解时间为120 min,底物浓度为1 g/100 mL,水解温度固定为45 ℃,考察加酶量分别为6000、10000、14000、18000和22000 U/g时水解物结合脱氧胆酸钠的能力。

1.2.5.3 底物浓度对水解物结合脱氧胆酸钠能力的影响 控制水解时间为120 min,加酶量为10000 U/g,水解温度固定为45 ℃,考察底物浓度分别为1、2、3、4和5 g/100 mL时水解物结合脱氧胆酸钠的能力。

1.2.5.4 水解温度对水解物结合脱氧胆酸钠能力的影响 控制水解时间为120 min,加酶量为10000 U/g,底物浓度为1 g/100 mL,考察水解温度分别为35、45、55、65和75 ℃时水解物结合脱氧胆酸钠的能力。

1.2.6 Box-Behnken响应面试验设计 在单因素实验的基础之上,选取水解时间(min)、底物浓度(g/100 mL)、加酶量(U/g)、水解温度(℃)为影响因素,绿豆蛋白水解物与脱氧胆酸钠的结合能力为考察指标,使用Design-Expert.V8.0.6软件进行表1所示的四因素三水平的响应面试验设计,优化绿豆蛋白水解的工艺条件。

表1 响应面试验因素和水平表Table 1 Factors and levels table of response surface test

1.2.7 水解物超滤分级和纯化 绿豆蛋白水解物离心后的上清液经过5 kDa的超滤管分级[22]、超滤后分别测定截留液和透过液结合脱氧胆酸钠的能力,选取结合脱氧胆酸钠能力较好的部分进行后续实验。

Sephacryl S-100 High Resolution凝胶层析柱对水解物的纯化分离[23],使用超纯水做洗脱液进行纯化收集。控制洗脱流速为0.8 mL/min,上样浓度为40 mg/mL,上样量为1 mL,检测波长为280 nm。收集得到的水解物进行冷冻干燥后测定其与脱氧胆酸钠的结合率。

1.3 数据处理

每组实验重复3次,使用GraphPad prism软件、SPSS 统计软件进行绘图和数据分析,Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。*表示显著差异,P<0.05;**表示非常显著差异,P<0.01;***表示极显著差异,P<0.001。

2 结果与分析

2.1 绿豆蛋白理化指标测定结果

标准曲线回归方程如表2所示。由标准曲线测得提取的绿豆粗蛋白的蛋白含量为78.27%,多糖含量为9.83%。

表2 蛋白和多糖标准曲线回归方程Table 2 Protein and polysaccharidestandard curve regression equation

此外,对绿豆粗蛋白中黄酮类和皂苷类物质进行了检测,检测结果表明绿豆粗蛋白中没有黄酮类和皂苷类物质的存在。基于以上结果,猜测剩余11.90%的成分可能是灰分、脂肪、水分等物质[24]。

2.2 水解酶的筛选

根据表3胆酸盐的标准曲线回归方程计算可以得到绿豆蛋白水解产物结合胆酸盐的能力,结果如表4所示。可以看出中性蛋白酶水解绿豆蛋白得到的水解物结合胆酸钠、牛磺胆酸钠的能力最强,与脱氧胆酸钠的结合率仅次于碱性蛋白酶,且差异不显著(P>0.05),说明使用中性蛋白酶得到的绿豆蛋白水解产物降血脂能力优于其他四种蛋白酶。而这五种蛋白酶水解绿豆蛋白得到的水解产物与脱氧胆酸钠的结合率又高于胆酸钠和牛磺胆酸钠,便于后续实验的测定,综合考虑后,选择中性蛋白酶作为水解绿豆蛋白的最佳酶进行后续实验,并将水解物与脱氧胆酸钠结合能力作为考察指标。

表3 胆酸盐标准曲线回归方程Table 3 Choline standard curve regression equation

表4 不同水解酶水解物的胆酸盐结合率Table 4 Percentage of cholate binding ofdifferent hydrolase hydrolysates

2.3 单因素实验结果

图1结果表明,水解时间(min)、底物浓度(g/100 mL)、加酶量(U/g)、水解温度(℃)对水解产物胆酸盐结合率均具有一定影响。采用中性蛋白酶进行单因素实验,在水解时间逐渐增大时(60～180 min),绿豆蛋白水解物结合脱氧胆酸钠的能力逐渐增大,之后随着水解时间的延长又减小,这可能是由于水解时间过长水解物活性降低导致的;底物浓度为3 g/100 mL时水解物结合脱氧胆酸钠能力较好,增大底物浓度结合脱氧胆酸钠能力反而降低,可能是因为底物浓度过高影响了底物与酶的接触面积,从而降低了水解效果,阻碍了降血脂水解物的产生;当加酶量为10000 U/g时,水解物结合脱氧胆酸钠能力较好,加酶量较低时,可能是酶结合底物的能力较弱,而过量的酶又使蛋白过度水解,从而导致水解物结合脱氧胆酸钠能力下降;温度的升高使得水解物结合脱氧胆酸钠能力随之增加,当温度升高到55 ℃后,水解物结合脱氧胆酸钠能力最好,之后随着温度的升高反而降低。其原因可能是45～55 ℃为中性蛋白酶的最适水解温度,在此温度范围内酶活力最高,此外,分子热运动随着温度的升高而加快并且溶剂的溶解力也增大,更有利于溶剂渗透与溶质扩散,从而使水解物活性更好。而温度过高会导致酶活力降低甚至失活,影响蛋白水解。

图1 各单因素对水解物结合脱氧胆酸钠能力的影响Fig.1 Effect of single factor on the ability of hydrolysate combined with sodium deoxycholate注:不同的字母表示具有显著性差异,P<0.05。

综上所述,在单因素实验的基础上选取水解时间120、150、180 min,底物浓度2、3、4 g/100 mL,加酶量6000、10000、14000 U/g,水解温度45、55、65 ℃进行响应面试验。

2.4 响应面优化水解工艺

2.4.1 响应面优化试验结果 响应面设计方案及结果见表5,每个实验做3组平行,取其平均值。采用Design-Expert 8.0.6软件对表5中的数据进行多元回归拟合,得到水解时间(A)、底物浓度(B)、加酶量(C)、水解温度(D)四个影响因素与响应值胆酸盐结合率(Y)之间的二次多项回归拟合方程:

表5 响应面实验设计方案及结果Table 5 Design and results of response surface experiment

Y=0.61-0.034A+0.020B+3.472E-003C-0.045D-0.030AB+0.029AC-0.038AD+0.028BC+0.037BD+0.022CD-0.091A2-0.061B2-0.064C2-0.063D2

上述方差分析表中的F值可以用来描述各个因素对水解产物结合胆酸盐的影响大小。F值越大,则此因素的影响效果就越强[29]。所以由表6可知各个因素对得率的影响大小顺序为:水解温度(D)>水解时间(A)>底物浓度(B)>加酶量(C)。

2.4.3 响应等高线图与曲面图分析 两个因素之间交互作用明显时等高线形状趋向椭圆并且其轴线与坐标轴之间形成一个明显的角度[30]。两个因素之间交互作用相对较弱时等高线趋向于圆形或者椭圆的轴线与坐标轴之间形成的角度相对较小;响应值对实验条件的变化非常敏感时其对应的响应曲面坡度陡峭,等高线密集排列;响应值对实验条件的变化相对来说没那么敏感时其对应的响应曲面坡度平缓,等高线疏松排列[31]。因此,由图2可以分析看出,四个因素之间均存在显著的交互作用。

图2 各因素交互作用对水解产物结合脱氧胆酸钠能力的影响Fig.2 Effect of interaction of various factors on the ability of hydrolysate combined with sodium deoxycholate

2.4.4 最佳水解工艺条件的确定与验证 软件分析得出绿豆蛋白水解产物最佳提取条件为:水解时间146 min,底物浓度3.1 g/100 mL,加酶量9861 U/g,水解温度52.1 ℃。在此工艺条件下,软件预测水解物与脱氧胆酸钠结合率为61.86%。进行结果验证,得到实际结果为60.46%,与理论值相接近,说明响应面法具有可行性。

2.5 绿豆蛋白水解物纯化

Sephacryl S-100 High Resolution凝胶层析柱对水解物的纯化分离。将经超滤管超滤后的截留液和透出液分别收集,测定其与脱氧胆酸钠的结合能力,结果表明截留液与脱氧胆酸钠的结合能力高于透出液。随后,将截留液过层析柱进一步分离纯化,得到洗脱峰,结果如图3所示。每4 mL收集一管,水解物集中在第26～36管。将洗脱峰收集测定与脱氧胆酸钠的结合能力,其活性明显提高,与脱氧胆酸钠结合率为70.54%,说明此部分绿豆蛋白水解物是发挥降血脂活性的主要基础物质。纯化后活性升高可能是由于纯化后一些影响活性的杂质被去除,说明Sephacryl S-100 High Resolution凝胶层析对水解物有一定的纯化分离效果。

图3 凝胶色谱图Fig.3 Gel chromatography

3 结论与讨论

本实验以绿豆蛋白为原料,从多种蛋白酶中筛选出中性蛋白酶进行水解,以其对胆酸盐的结合能力为指标,得到具有较好降血脂作用的绿豆蛋白水解物。使用中性蛋白酶水解绿豆蛋白得到的水解物降血脂作用更好,可能是因为其酶切位点更有利于降血脂水解物的生成。之后采用单因素实验与响应面试验相结合的方法优化水解工艺,结果表明最佳水解条件为:水解时间146 min,底物浓度为3.1 g/100 mL,加酶量为9861 U/g,水解温度为52.1 ℃,在此条件下得到的水解产物与脱氧胆酸钠结合率为60.46%,与模型预测值61.86%的相对误差仅为2.26%,说明该模型可以较好地描述与预测水解绿豆蛋白的最佳工艺条件。

同时发现在最优条件下制备的绿豆蛋白水解物经超滤后能得到降血脂活性较好的截留液,说明分子量大于5 kDa以上的水解物保留的降血脂活性较好,一方面可能是5 kDa以上的水解物有更大的分子结构,能够吸附更多的胆酸盐,另一方面,可能是因为5 kDa以上水解物的氨基酸排列顺序能够更好地起到降血脂的作用。使用Sephacryl S-100 High Resolution凝胶层析柱对截留液进一步分离纯化,结果显示纯化后的水解物降血脂活性更强,可能是由于纯化后的水解物分子量更集中,更利于与胆酸盐的结合。

本实验为绿豆蛋白水解物降血脂作用的研究提供了一定的理论参考,但关于绿豆蛋白降血脂水解产物的结构性质以及具体的作用机制有待进一步深入的研究。