川西高原发酵牦牛乳中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选与耐受性研究

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

亚硝酸盐在食品中广泛存在,主要作为防腐剂和护色剂应用在蔬菜和香肠中[1]。由于在胃中亚硝酸盐会转化成有害的胺类物质,尤其是亚硝胺具有强烈的致癌作用[2-4],还会引发高铁血红蛋白症,使红细胞失去携氧能力,组织缺氧直至死亡,所以经常食用含有亚硝酸盐的食品会引发机体癌变,还有致畸的风险,有效降低亚硝酸盐的方法已经成为近几年的热点问题[5-6]。

乳酸菌以糖类发酵产生乳酸,是功能性显著的益生菌[7-11]。目前已经有研究证明乳酸菌的代谢产物酶和生长过程中产生的乳酸均对亚硝酸盐具有降解作用[12-13],减少了亚硝酸盐的积累[14-15],如食品的活菌发酵,通过作用于N-亚硝胺前体物,能够降解亚硝酸盐[16-17]和抑制胺类物质形成[18]。传统发酵牦牛乳通过长期自然发酵构成其优势菌群,其优良性能得以保存,因此从传统发酵牦牛乳中筛选出具有降解亚硝酸盐能力的功能性乳酸菌极具可行性。

乳酸菌对外界环境较为敏感,尤其是在进入人体消化道内,消化道中分泌的各种消化液和消化酶也会影响其生存与繁殖。为了研究具有降解亚硝酸盐能力的优势菌株能否在人体消化道内存活并发挥作用,在模拟人体消化环境中培养并观察其存活状态。模拟人体消化道,就是在体外创造和人体消化道相似的环境。国外早有研究,Izquierdo等[19]模拟胃肠道环境进行实验,结果表明不同菌株的耐受性存在差异。

本实验以195株分离自川西高原传统发酵牦牛乳中的乳酸菌为研究对象,筛选出具有亚硝酸盐降解能力的优势菌株,进而研究优势菌株对人体消化环境的抵抗力,为其能否作为益生菌在人体肠道中发挥功效提供理论依据,同时对功能性食品的研发有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

195株乳酸菌 分离自31份川西高原不同发酵牦牛酸乳样品;MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基 成都瑞普信生物技术有限公司;亚铁氰化钾、乙酸锌、冰乙酸、硼酸钠、盐酸、氯化钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氢氧化钠、磷酸氢钾 成都市科龙化工试剂厂;胃蛋白酶(酶活力1∶3000)、胰蛋白酶(酶活力1∶250) 如吉生物科技公司;牛胆盐 科汉森公司。

UV-2000紫外分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;PYX-DHS-50X65-BS-Ⅱ型隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗机械厂;高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-1F型单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;MP512-02型精密pH计 德国Matthaus公司;ZWY-100H型恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的传代培养与活化 将195株乳酸菌按4%的比例接种于MRS肉汤培养基中,并混匀,在37 ℃恒温培养箱中培养24 h,传代培养两代后得到生长状况良好的菌液。

1.2.2 乳酸菌降解亚硝酸盐能力实验 根据国标GB 5009.33-2016中的盐酸奈乙二胺法[20],检测川西高原传统发酵牦牛乳中分离出的195株待测菌株亚硝酸盐的降解能力。在波长538 nm处测出吸光度,以亚硝酸盐质量浓度(x)为横坐标,吸光度(y)为纵坐标,绘制亚硝酸盐标准曲线,回归方程为y=0.5736x-0.0015,决定系数R2=0.9957。取活化后的菌株吸取50 μL菌液接种到5 mL MRS肉汤培养基(含150 mg/L亚硝酸钠)中,于37 ℃静置培养24 h后按盐酸奈乙二胺法要求处理,在波长538 nm处测残余亚硝酸盐吸光值,代入亚硝酸盐标准曲线回归方程测定剩余亚硝酸盐质量浓度并计算降解率,对每株菌降解亚硝酸盐能力测定重复3次,降解率公式如下:

式中:B0为培养基中亚硝酸盐原始质量浓度,mg/L;B1为发酵后残余亚硝酸盐质量浓度,mg/L。

1.2.3 模拟人工胃液耐受力实验 用蒸馏水稀释2 mL 1 mol/L的盐酸,调节pH分别达到1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。以1 g/100 mL的比例加入胃蛋白酶,充分溶解,用0.20 μm的微孔滤膜除菌。将活化后的菌液以10%的体积分数接种于处理好的人工胃液中,混匀后进行37 ℃、100 r/min恒温摇床培养[21],用涂布稀释法分别测定0、1、2、3和4 h时的活菌数,每个时间段重复测定三次。

1.2.4 模拟人工肠液耐受力实验 取3.4 g KH2PO4加入蒸馏水250 mL,采用NaOH溶液调节pH至7.6后稀释至500 mL,以1 g/100 mL的比例加入胰蛋白酶,充分溶解。用0.20 μm的微孔滤膜除菌。将活化后的菌液以10%的接种量接种于处理好的人工肠液中,混匀后进行37 ℃、100 r/min恒温摇床培养[22],用涂布稀释法测定0、1、2、3和4 h时的活菌数,每个时间段重复测定三次。

1.2.5 耐胆盐实验 分别配制胆盐质量浓度为0、0.03、0.08、0.13、0.18、0.23、0.28和0.33 g/100 mL(8个梯度)的MRS肉汤培养基,121 ℃高压蒸汽灭菌15 min,冷却,将活化后的菌液以10%的体积分数接种到该培养基中,37 ℃恒温培养24 h,用涂布稀释法进行活菌计数,重复测定三次。

1.2.6 耐高盐实验 配制NaCl质量浓度分别为0、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 g/100 mL(8个梯度)的MRS肉汤培养基,121 ℃高压蒸汽灭菌15 min,冷却,将活化后的菌液以10%的体积分数接种到该的培养基中,37 ℃恒温培养24 h,用涂布稀释法进行活菌计数[23],重复测定三次。

1.3 数据处理

运用Excel软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 具有降解亚硝酸盐能力菌株的筛选结果

通过对195株乳酸菌的亚硝酸盐降解率进行统计(表1),总体上观察可知,不同菌株降解亚硝酸盐的能力不同,亚硝酸盐降解率范围为35.79%～96.51%。由图1可知,降解率在80%～90%的菌株数量最多,占比54.87%,仅有1.54%的菌株亚硝酸盐,降解率在50%以下,23.08%的菌株降解率在80%以下,98.46%的菌株降解率在95%以下,而降解率在95%以上的菌株有3株,占总数的1.54%。这三株乳酸菌分别是菌株5、26和150,它们显示出了较强的降解亚硝酸盐的能力。在这3株菌中,菌株26和菌株150的亚硝酸盐降解率分别为95.64%和95.06%,菌株5的亚硝酸盐降解率最高,达到了96.51%。后续对3株优良的亚硝酸盐降解能力极强的菌株进行耐受力研究。

表1 195株菌亚硝酸盐降解率(%)Table 1 Nitrite degradation rate of 195 strains(%)

图1 195株菌亚硝酸盐降解率统计图Fig.1 Statistical diagram of nitrite degradation of 195 strains

2.2 对人工胃液耐受力的实验结果

乳酸菌需要通过口腔进入人体胃肠道才能发挥作用,胃液的pH一般在3.0左右,通过胃的时间一般为1～2 h。而胃液的酸性环境会刺激胃蛋白酶原发挥作用,杀死食物中的细菌[24],这就要求所筛选的乳酸菌必须具有耐酸和耐胃蛋白酶的能力。由图2～图4可以看出,在不同的pH下,3株乳酸菌的活菌数随培养时间的延长均逐渐减少,菌株26下降的趋势最为明显,菌株5稍缓。在培养3 h时后,菌株5、26、150在pH5.5时的活菌数分别为3.7、3.6、4.1×108CFU/mL,均保持在较高的水平。其中菌株150在pH为1.5的人工胃液中作用一段时间后稍有减少,在pH2.5～5.5的人工胃液中保持了较高的活力,相对于其他两株菌有较高的耐受性。

图2 菌株5在不同pH的人工胃液中在不同时间的活菌数Fig.2 Number of viable cells of strain 5 at different timein artificial gastric juice with different pH

图3 菌株26在不同pH的人工胃液中在不同时间的活菌数Fig.3 Number of viable cells of strain 26 at different timein artificial gastric juice with different pH

图4 菌株150在不同pH的人工胃液中在不同时间的活菌数Fig.4 Number of viable cells of strain 150 at different timein artificial gastric juice with different pH

2.3 对人工肠液耐受力的实验结果

乳酸菌经过胃液后进入肠液,肠液pH大约为7.6,食物通过小肠的时间约为4 h[25]。乳酸菌需对小肠液有一定的耐受性,只有在一定时间内保持足够的数量才能发挥作用。如图5可知,在人工肠液中培养4 h后,菌株5、26、150的活菌数分别为4.3、6.8、5.3×108CFU/mL,均保持在较高水平,表现了良好耐受力。但菌株26和菌株150在人工肠液中的活菌数变化不大,随培养时间便逐渐减少。菌株5和菌株150在4 h时存活率分别为34.96%、46.49%,而菌株26在4 h时存活率则达到了51.13%,表明菌株26对胰蛋白酶的耐受力高于菌株5和菌株150。

图5 3株乳酸菌在人工肠液中培养后的活菌数Fig.5 Number of viable cells of 3 strains oflactic acid bacteria cultured in artificial intestinal juice

2.4 耐胆盐实验结果

小肠中胆汁浓度在0.03%～0.30%范围内波动[26],乳酸菌必须能在高胆盐环境中存活才能发挥其性能,所以可以检测这3株菌在不同的胆盐浓度中的生存情况来判断其对胆盐的耐受力强弱[27]。如图6可知,3株菌在不同胆盐浓度的MRS培养基中培养24 h后,其活菌数随胆盐浓度的增加而减少。其中在胆盐浓度0.33 g/100 mL菌株5的活菌数最高,为1.12×108CFU/mL,菌株26、150活菌数也在108CFU/mL以上,证明它们对胃肠道有良好的适应性,可以在食品工业中有很好的应用。

图6 3株乳酸菌在胆盐中培养后的活菌数Fig.6 Number of viable cells of 3 strains oflactic acid bacteria cultured in bile salts

2.5 耐高盐实验结果

当盐浓度增加时,水会透过细胞膜向高浓度的外界环境转移,菌体内水分越来越少。会严重影响菌体内部的各种生化反应,严重时反应都将终止,结果便是菌体死亡[28]。3株菌在人体肠道的NaCl浓度范围内要有一定的活性。由图7可知,3株菌在不同的NaCl质量浓度的MRS肉汤中培养24 h之后,活菌数都随NaCl质量浓度的升高而减少,并且质量浓度越高对活菌数的影响越大,但活菌数均在108CFU/mL以上,在4 g/100 mL的浓度下也能存活,说明这3株亚硝酸盐降解能力极强的菌株都对NaCl有较好的耐受力,可以在人体消化道的渗透压条件下生存并且发挥作用。此外,菌株5下降的趋势较为缓慢,表明其相对于菌株26和菌株150有更高的耐高盐能力。

图7 3株乳酸菌在高盐环境中培养后的活菌数Fig.7 Number of viable cells of 3 strains oflactic acid bacteria cultured in high salt environment

3 结论

本研究对川西高原发酵牦牛乳中分离出的195株乳酸菌进行降解亚硝酸盐能力的筛选,各菌株的耐受力存在较大差异,其中有3株乳酸菌的降解率在95%以上,经16 S rRNA测序,菌株5和26均为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum),菌株150为德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbruckii)。其中降解率最高的是菌株5,降解率为96.51%。根据耐受力实验,可看出3株菌对人工胃液的耐受性良好,菌株150在胃液中的耐受性相较于其他两个菌株更强;3株乳酸菌对人工肠液也有很好的耐受性,活菌数随培养时间的延长而减少,培养4 h后活菌数最高的是菌株26;3株菌在胆盐中培养时也表现出了较强的耐受性,其活菌数随胆盐浓度的增加而减少;在不同浓度梯度的高盐MRS肉汤培养基中培养3株菌,24 h后检测到的活菌数随NaCl浓度的升高而减少,但都表现了很强的耐渗透压的能力,其中较强的是菌株5。

因此,这些实验表明了川西高原藏区传统发酵牦牛乳中分离出的这195株乳酸菌具有很好的亚硝酸盐降解能力,其中筛选出的3株降解亚硝酸盐的优良菌株在人工胃液、人工肠液、胆盐和高盐四个模拟人工胃肠道消化环境中均能够存活,且生长状况良好,表现出了这3株乳酸菌良好的耐受性。可以此为基础,后续研究可对相关采样地的传统发酵牦牛乳中的微生物进行更加深入探究,寻找其中的多功能优势菌。本研究仅仅对乳酸菌亚硝酸盐降解能力及耐受力进行了探究,后续还可在分子水平上对菌株发酵特性的差异进行分析,探究不同种类乳酸菌在基因表达上的差异。由于乳酸菌在医药,食品和生物领域的应用较广,本研究对川西地区传统发酵乳制品的研究及功能食品的开发有着重要意义。