大黄治疗慢性肾衰竭的网络药理学机制

李林， 孙晓静， 孙治中， 陈曦霞， 张玲， 曾笑晴， 汤水福， 程德金

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院肾病科，广东广州 510400；3.广州中医药大学，广东广州 510006）

流行病学显示，慢性肾脏病的发病率约为10.8%[1]。慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）是在各种慢性肾脏病基础上缓慢出现肾功能进行性减退直至衰竭的一种临床综合征，属于中医学“溺毒”“癃闭”“关格”“肾劳”“虚劳”等病证的范畴。目前，西医治疗慢性肾衰竭主要以治疗原发病及并发症为主，对于进行至终末期肾病的患者，一般采用肾脏替代疗法。中医药在治疗慢性肾衰竭方面有明显的优势，中药大黄在治疗慢性肾衰竭方面尤为突出[2-3]。然而，目前对于单味中药大黄治疗慢性肾衰竭的具体机制尚不明确，因此，本研究运用网络药理学从分子水平预测大黄治疗慢性肾衰竭的作用机制，以期为下一步深入研究提供参考和指导，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 活性成分的获取以“大黄”为检索词，通过中药系统药理学技术平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）检索其化学成分，将口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 作为活性成分筛选条件，筛查出符合条件的活性成分，点击其成分的详细信息，保存活性成分的2D结构。

1.2 预测大黄相关靶点从Pubchem 数据库中检索筛选出大黄的活性成分，找出它们对应的smile号，保存为SDF文件，上传至SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/），基于反向分子对接原理，依据各成分的2D/3D结构进行靶点预测，得到大黄的预测靶点。

1.3 慢性肾衰竭相关靶点的获取及与大黄预测靶点的映射以“chronic renal failure”为检索词，通过GeneCards 数据库获取慢性肾衰竭相关靶点。将大黄的预测靶点与慢性肾衰竭相关靶点进行映射，得到大黄治疗慢性肾衰竭的预测靶点。

1. 4 蛋白与蛋白相互作用（PPI）网络的构建通过String 数据库设定物种为“Homo snpiens”获取全部蛋白—蛋白相关作用关系，导入Cytoscape 3.6.0 软件，生成背景网络。在背景数据库选中上述映射得到的大黄作用于慢性肾衰竭的靶点，并找到与其直接相连的节点，作为大黄治疗慢性肾衰竭的PPI网络。

1. 5 Hub 网络的提取通过Cytoscape 3.6.0 软件Tools 模块中的NetworkAnalyzer-Network Analysis-Analyze Network 进行网络分析获取相关拓扑参数，选取节点连接度（degree）的二倍中位数、节点介度（betweenness）和节点紧密度（closeness）的中位数作为筛选依据，提取出Hub网络。

1.6 基因本体论（GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析应用Cytoscape 3.6.0 软件中ClueGO 插件， 选择生物进程（Biological Process），对Hub网络中的靶标进行GO富集分析。通过DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）网站对上述分析结果进行KEGG通路分析并进行筛选，得到显著富集（P ＜0.01）的通路，并按照gene数从大到小排序。结合文献检索，筛选出治疗慢性肾衰竭的可能通路，找到其通路上的相关靶标，结合大黄的活性成分，构建出“大黄活性成分—慢性肾衰竭靶标—KEGG通路”的网络图。选取gene 数排名前20 的通路，使用OmicShare 网站（http：//www.omicshare.com/tools/）绘 制 通 路 气 泡图。

2 结果

2.1 大黄活性成分本研究将OB ≥30%、DL ≥0.18 作为活性成分筛选条件，筛选出活性化合物16种，化合物名称、相关参数及化学结构式见表1。

2.2 大黄预测靶点以及活性成分—慢性肾衰竭靶点网络构建从SwissTargetPrediction 数据库中筛选出16 种活性化合物对应的240 个靶点，再依据成分的2D/3D结构进行靶点预测，筛选出122个靶点作为大黄的预测靶点。将所得的大黄预测靶点与GeneCards 数据库获取的6 329 个慢性肾衰竭相关靶点相映射，最后筛选出大黄可能与慢性肾衰竭相关的靶点93 个。在Cytoscape 3.6.0 软件中导入大黄的活性成分与慢性肾衰竭相关的靶点，构建大黄活性成分—慢性肾衰竭靶点网络图，如图1所示。

表1 大黄活性成分Table 1 The data of the active components of Radix Et Rhizoma Rhei

2.3 PPI 网络的构建将93 个大黄可能与慢性肾衰竭相关的靶点导入String数据库蛋白—蛋白相关作用关系，通过Cytoscape 3.6.0 软件，形成大黄治疗慢性肾衰竭的PPI 网络。见图2。图中节点大小是按degree值的大小形成，degree值越大，节点越大。

图1 大黄活性成分—慢性肾衰竭靶点网络图Figure 1 Radix Et Rhizoma Rhei active components-CRF targets network

图2 大黄治疗慢性肾衰竭的PPI网络Figure 2 PPI network of Radix Et Rhizoma Rhei treatment for CRF

2.4 Hub网络的提取及Hub中的靶标选取degree的二倍中位数、betweenness 和closeness 的中位数作为筛选依据，通过Cytoscape 3.6.0 软件得到Hub中的靶标，即大黄治疗慢性肾衰竭的关键靶点，提取出Hub 网络。见图3。图3 中黄色示大黄和慢性肾衰竭相关的靶点，红色示大黄和慢性肾衰竭相关的靶点在人类基因库中直接相关的靶点。关键靶点共30 个，按照degree 值从大到小排序分别为：SRC、ESR1、CSNK2A1、FYN、AR、CASP3、GRB2、 TP53、 LCK、 LYN、 STAT3、 MAPK1、PIK3R1、 CREBBP、 EP300、 SHC1、 EGFR、PRKCA、SMAD3、STAT1、PTPN11、BCL2、PLCG1、NR3C1、ABL1、JUN、CSNK2A2、MAPK3、AKT1、RELA。

2.5 GO富集分析应用Cytoscape 3.6.0中ClueGO插件，进行GO 富集中的BP 分析，得到11 个功能组别（见图4）以及其占比饼状图（见图5）。

2. 6 KEGG 通路分析通过KEGG 通路分析得到122条通路，结合文献检索，筛选出治疗慢性肾衰竭的可能通路为20 条，绘制通路气泡图。见图6。分别为磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）—苏氨酸激酶（Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、Ras信号通路、Foxo信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、胰岛素信号通路、核因子κB（NF-κB）信号通路、低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、Toll 样受体信号通路、Janus 激酶（JAK）—信号转导子和转录激活子（STAT）信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、Wnt 信号路、Hippo 信号通路、P53 信号通路、转化生长因子β（TGF-β）信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路、Notch 信号通路、醛固酮调节钠重吸收通路。

3 讨论

慢性肾衰竭的共同病理表现为肾脏纤维化，肾脏纤维化的持续发展最终将导致肾衰竭，因此，有效缓解肾纤维化就能有效延缓慢性肾衰竭的进展。

图3 Hub网络Figure 3 Hub network

图4 GO富集分析功能组别图Figure 4 Functional group diagram of GO enrichment analysis

图5 GO富集分析功能组别占比饼状图Figure 5 Pie chart of functional group proportion by GO enrichment analysis

3.1 靶点预测预测结果表明，大黄治疗慢性肾衰竭的关键靶点有30个，按degree值（从大到小排序）具体为SRC、ESR1、CSNK2A1、FYN、AR、CASP3、 GRB2、 TP53、 LCK、 LYN、 STAT3、MAPK1、PIK3R1、 CREBBP、 EP300、 SHC1、EGFR、 PRKCA、 SMAD3、 STAT1、 PTPN11、BCL2、PLCG1、NR3C1、ABL1、JUN、CSNK2A2、MAPK3、AKT1、RELA。

其中包括促进肾纤维化和抑制肾纤维化的靶点，如SRC 为促进肾纤维化靶点。SRC 属于非受体细胞内酪氨酸蛋白激酶家族，在细胞中广泛存在，当其在Tyr416 位点磷酸化而活化后可以进一步激活TGF-β1、STAT3、EGFR 促纤维化的信号通路，在肾间质纤维化发生及加重过程中有重要意义。研究表明，通过PP1抑制SRC活化后可通过抑制内吞而使MMP-2活性提高，而MMP-2活性提高后可促进细胞外基质的降解，有助于肾间质纤维化的逆转。因此，本研究进一步支持SRC 作为肾间质纤维化治疗潜在靶点的可能性[4]。

图6 大黄治疗慢性肾衰竭前20条富集通路气泡图Figure 6 Bubble diagram of the top 20 of pathway enrichment

而大部分靶点通路可以延缓肾纤维化，改善肾功能。如STAT3、STAT1 可通过调控JAK1、JAK2、STAT3的基因达到改善肾功能目的[5]。

3.2 大黄治疗慢性肾衰竭的预测通路预测通路共20 个，分别为PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、Ras信号通路、Foxo信号通路、TNF信号通路、胰岛素信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路、VEGF 信号通路、Toll 样受体信号通路、Jak-ATAT 信号通路、cAMP 信号通路、Wnt 信号路、Hippo 信号通路、P53 信号通路、TGF-β 信号通路、AMPK 信号通路、mTOR 信号通路、Notch信号通路、醛固酮调节钠重吸收通路。

肾纤维化是各种慢性肾脏疾病发展为慢性肾衰竭的共同途径。目前，关于肾纤维化相关研究的信号通路包括TGF-β1/Smad 通路、血小板衍生生长因子（PDGF）/PDGF 受体（PDGFR）信号通路、Wnt/β-catenin通路和MAPK相关信号通路等[6]。

既往研究表明，大黄的最主要活性成分为大黄酸、大黄素。通过对梗阻性肾病模型的研究得到证实，大黄酸可以不同程度抑制肾间质纤维化，保护残余肾功能，延缓肾功能进展，同时，可以下调α-SAM 和TGF-β1 的表达[7]。TGF-β1 是一种重要的细胞因子，它通过控制细胞外基质（ECM）的合成与降解而促使肾脏的纤维化加剧[8]。此外，大黄酸可下调氧化损伤标志物的表达，从而延缓肾脏纤维化[9]。大黄素能降低糖尿病肾病大鼠肾组织中纤连蛋白的表达，阻止p38 MAPK 通路的激活[10]，下调肾脏内TNF-α 与白细胞介素（IL）-6 的表达，抑制肾小球上皮细胞的增生，下调Toll 样受体4 的表达，缓解肾脏的炎症状态[11]，阻断NRK-49F细胞激活p38/ERK1/2 信号通路，抑制细胞外基质的形成[12]，从而延缓肾脏纤维化。

综上所述，大黄对慢性肾衰竭的治疗作用体现了中药多成分、多靶点、多通路的特点，其机制主要与调控肾纤维化相关通路有关，为后续的深入研究奠定了基础。