石斛碱调节JNK信号通路对白血病细胞存活和上皮间质转化的影响

郭涛， 纪冬梅， 李艳平， 卢阳， 弋莉， 王晓红

（朝阳市中心医院血液内科，辽宁朝阳 122000）

急性T 淋巴细胞白血病（T-acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）是一种起源于T细胞祖细胞恶性转化的血液系统恶性肿瘤，占儿科病例的15%，占成人病例的25%[1]。在大多数儿童白血病患者中化疗非常有效，且随着对T细胞生物学理解的不断加深，目前儿童的5 年存活率可达到65%～70%，而成人患者仅30%～50%[2-3]。T-ALL的治疗方法包括单药化疗、分子靶向治疗、造血干细胞移植和细胞免疫治疗等，由于供体骨髓来源限制、费用高、并发症严重，目前仍以化疗为主要策略[4]。因此，增强治疗效果、改善预后是T-ALL 治疗亟待解决的问题，同时探索新的、更有效的药物或治疗策略也是十分重要的医学内容。我国传统名贵中药金钗石斛是兰科石斛属多年生附生草本植物，具有益胃生津、滋阴清热、延年益寿的功效。石斛碱（dendrobine）是一种倍半萜类生物碱，是金钗石斛的主要有效成分之一，现代药理学证明，其有抗高血压、抗癌、镇痛和解热等作用[5-11]。基于此，本研究以体外培养的人皮肤T 细胞淋巴瘤HuT-78细胞为研究对象，探讨石斛碱对白血病细胞体外存活和转移特性的影响，以期为T-ALL 的临床治疗提供实验数据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及培养人皮肤T细胞淋巴瘤HuT-78细胞株来源于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），以含有体积分数10%胎牛血清和1%青-链霉素的RPMI 1640 培养基于37 ℃、体积分数5% CO2的恒温培养箱中培养。镜下观察细胞生长状态，当细胞融合率达到80%以上时进行消化传代。

1. 2 药物石斛碱（纯度≥98%，货号：2115-91-5），分子式：C16H25NO2，购自武汉天植生物技术有限公司，用二甲基亚砜（DMSO）配制成浓度为1 mg/mL母液，使用时用细胞培养基作相应稀释。

1. 3 试剂RPMI 1640、胎牛血清、2.5 g/L 胰酶购自美国Gibco 公司； 细胞计数试剂盒8（CCK8）（用于细胞增殖及毒性检测）、Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒、结晶紫染色液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Matrigel 购自美国Invitriogen 公司；Transwell 小室购自北京优尼康生物技术有限公司；RIPA 裂解液购自南京碧云天生物技术公司；兔源Ki67、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3（cl-caspase-3）、cleaved caspase-9（cl-caspase-9）、细胞色素C（CC）、 E-钙粘附素（E-cadherin）、N-钙粘附素（N-cadherin）、Snail、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）、p38、磷酸化p38（p-p38）、β-actin 单/多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自美国Abcam公司。

1.4 仪器CO2培养箱（美国ThermoForma 公司）；电泳仪及半干转膜仪（美国伯乐公司）；Gel View 6000化学发光凝胶成像系统（广州云星仪器有限公司）；超净工作台（苏州中亚净化设备有限公司）；普通光学显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 CCK8实验测定细胞存活率 将HuT-78细胞接种于96 孔板，待细胞贴壁后，随机分为9 个石斛碱浓度（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL）组，每组设6 个复孔。每组分别给予对应浓度的石斛碱处理24 h 后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，继续孵育4 h，用酶标仪在450 nm 波长处测定各孔的吸光度（D）值。细胞存活率（%）=（D药物- D空白）/（D对照- D空白）×100%。D药物：含药孔D 值；D空白：不含细胞和药物孔D 值；D对照：含细胞不含药物孔D 值。根据细胞存活率结果选择石斛碱无明显细胞毒性（大于80%）的3 个浓度（1、2.5、5 μg/mL）进行后续实验。

1.5.2 克隆形成实验测定细胞增殖能力 接种细胞于6孔板内，每孔1×106个细胞，待细胞融合率达80%，分组后分别加入对应浓度的药物处理24 h。收集各组细胞，每组取1 000 个细胞接种到6孔板中，继续培养10 d。用体积分数20%乙醇固定克隆，0.4%结晶紫染色。镜下观察并计算各组克隆数。

1.5.3 流式细胞术测定细胞凋亡率 接种细胞于6 孔板内，每孔1 × 106个细胞，待细胞融合率达80%时，分组后加入对应终浓度药物处理24 h。收集细胞，调整密度至1×106个/mL。严格按照试剂盒说明书操作，取100 μL 加入5 μL 的Annexin VFITC 和10 μL 的PI 染色液，室温避光孵育15 min后，上机检测。

1.5.4 Transwell 实验测定细胞侵袭迁移能力 将HuT-78 细胞接种于提前用Matrigel 基质胶包被好的Transwell 小室上层，细胞密度为1 × 105个/mL，加入不含胎牛血清的培养液培养，Transwell 小室下层则加入正常细胞培养液。继续培养24 h 后，用无菌棉签拭去Matrigel 基质胶和小室上层细胞，后用4%多聚甲醛固定小室，再用0.1%结晶紫染色细胞，流水冲洗去除多余染料并晾干。显微镜下每组随机选取5个视野，对染色细胞进行计数统计。实验至少重复3次，每组6个复孔。

1. 5. 5 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测Ki67、Bcl-2、Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9、CC、E-cadherin、N-cadherin、Snail、MMP-2、MMP-9、JNK、p38表达水平 将HuT-78细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分组加入不同浓度石斛碱，继续培养24 h后收集各组细胞。用RIPA 蛋白裂解液于冰上裂解细胞提取细胞总蛋白，4 ℃离心收集上清，用BCA 试剂盒定量蛋白。取等量蛋白质用12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白后，转移蛋白质到PVDF 膜。用50 g/L脱脂奶粉室温封闭蛋白质2 h，分别加入稀释度为1∶200的一抗（Ki67、Bcl-2、Bax、cl-caspase-3、cl-caspase - 9、 CC、 E-cadherin、 N - cadherin、Snail、MMP-2、MMP-9、JNK、p38），4 ℃孵育过夜。弃去一抗，加入辣根过氧化物酶标记的对应二抗，室温孵育1 h。滴加ECL 于暗室曝光显影。以β-actin 为内参，通过凝胶成像仪分析目的蛋白与内参蛋白的灰度计算其相对蛋白表达水平（p）。

1.6 统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，实验结果以均数±标准差(±s)表示。多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 石斛碱抑制体外培养HuT-78 细胞的增殖CCK8 法测定不同浓度石斛碱处理后HuT-78 细胞的存活率，结果显示：随着石斛碱处理浓度的增加，HuT-78 细胞存活率逐渐降低，且浓度大于5 μg/mL时细胞存活率低于80%，并存在统计学差异（P ＜0.05 或P ＜0.01），见图1-A。故选择无明显细胞毒性的1、2.5和5 μg/mL进行后续实验。

克隆形成实验观察石斛碱对HuT-78细胞体外增殖能力的影响，结果显示：与空白对照组比较，石斛碱剂量依赖性地抑制HuT-78细胞的克隆形成数量和增殖蛋白Ki67 表达水平（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图1-B，-C。

图1 石斛碱对HuT-78细胞增殖能力的影响Figure 1 Effects of DEN on proliferation of HuT-78 cells

2.2 石斛碱促进体外培养HuT-78细胞的凋亡流式细胞术和Western Blot实验观察石斛碱对HuT-78细胞凋亡的影响，结果显示：与空白对照组比较，石斛碱剂量依赖性地增加HuT-78 细胞的凋亡率，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平，上调促凋亡蛋白Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9、CC 表达水平（P ＜0.05或P ＜0.01）。见图2-A，-B。

2.3 石斛碱抑制体外培养HuT-78 细胞上皮间质转化Transwell 实验和Western Blot 实验观察石斛碱对HuT-78细胞侵袭能力的影响，结果显示：与空白对照组比较，石斛碱剂量依赖性地减少HuT-78 细胞侵袭数量，下调间充质标记蛋白Ncadherin、Snail、MMP-2、MMP-9表达水平，上调上皮标记蛋白E-cadherin 表达水平（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见图3-A，-B。

2.4 石斛碱促进体外培养HuT-78 细胞JNK、p38磷酸化表达Western Blot实验观察石斛碱对HuT-78细胞JNK、p38磷酸化的影响，结果显示：与空白对照组比较，石斛碱剂量依赖性地增加p-JNK/JNK、p-p38/p38蛋白表达水平（P ＜0.05）。见图4。

2.5 石斛碱逆转JNK抑制剂SP600125对增殖、凋亡及上皮间质转化相关蛋白Ki67、MMP-2、clcaspase-3、p-JNK/JNK 表达的影响Western Blot实验观察石斛碱和/或SP600125 对细胞Ki67、MMP-2、cl-caspase-3、p-JNK/JNK 表达水平的影响，结果显示：与空白对照组比较，石斛碱组细胞低表达Ki67、MMP-2蛋白，高表达cl-caspase-3、p-JNK/JNK 蛋白（P ＜0.05）；SP600125 组细胞则高表达Ki67、MMP-2蛋白，低表达cl-caspase-3、p-JNK/JNK 蛋白（P ＜0.05）；与SP600125单独处理组比较，石斛碱和SP600125 共同处理组细胞Ki67、MMP-2 蛋白表达降低，cl-caspase-3、p-JNK/JNK蛋白表达增加（P ＜0.05）。见图5。

3 讨论

图2 石斛碱对HuT-78细胞凋亡率的影响Figure 2 Effects of DEN on apoptotic rate of HuT-78 cells

正常情况下，T 细胞发育受到系统性严格调控，是造血祖细胞迁移到胸腺分化为功能多样的T淋巴细胞亚群的过程[12]。在此过程中，致癌基因的异常激活和抑癌基因表达降低或缺失均能导致胸腺前体不受控制的克隆扩张，进而导致T-ALL 发生[13]。因此，抑制T 淋巴细胞不正常分化是治疗T-ALL 的关键。Ki67 是一种增殖细胞核抗原，与细胞有丝分裂密切相关，被认为是肿瘤标记物之一[14]。在本研究中，我们发现石斛碱能抑制体外培养的HuT-78细胞增殖能力及增殖关键蛋白Ki67的表达水平，且当浓度大于5 μg/mL时可对细胞产生明显的毒性作用。

此外，本研究发现石斛碱除在一定浓度范围内剂量依赖性地抑制人HuT-78细胞增殖外，还能诱导肿瘤细胞凋亡，并调节凋亡关键蛋白的表达（下调抗凋亡蛋白Bcl-2，上调促凋亡蛋白Bax、cl-caspase-3、cl-caspase-9和CC）。细胞凋亡是机体生理和病理过程中均存在的细胞程序性死亡形式，而细胞凋亡抵抗是肿瘤发展进程的特点之一。在正常条件下，Bcl-2能够与Bax形成异源二聚体，维持膜电位阻止CC释放。当细胞受到各种异常刺激后，Bax 表达升高，Bax 自身形成同源二聚体从而拮抗Bcl-2 对膜电位的维持作用，CC 从线粒体中释放并与pro-caspase-9形成凋亡体激活caspase-9，进而激活下游级联caspase-3，从而引起细胞凋亡，这是经典的线粒体依赖的凋亡通路[15]。本研究结果表明石斛碱促肿瘤细胞凋亡作用的机制可能是通过此通路实现的，但仍不排除非线粒体依赖的凋亡通路参与其中。

肿瘤细胞发生上皮间质转化易于侵袭转移，在癌症的发展进程中发挥着重要作用。Ecadherin是一种重要的细胞粘附因子，其表达下调或缺失，伴随着N-cadherin 的表达上调，通过与β-catenin 连接形成复合物维持上皮细胞稳定性，促进细胞间的相互作用。Snail 结合到E-cadherin的启动子上可抑制其基因转录，从而参与上皮间质转化进程[16-17]。另外，Khalil 等[18]报道，MMP-2和MMP-9 可作为肿瘤侵袭和迁移特性的标记物，其表达水平可解释肿瘤侵袭性高低。本研究结果表明，石斛碱可剂量依赖性地抑制Hut-78 细胞的侵袭迁移，同时降低N-cadherin、Snail、MMP-2和MMP-9 蛋白表达，增加E-cadherin 蛋白表达，进而有效维持细胞间的粘附，降低细胞极性丢失，从而降低HuT-78细胞上皮间质转化发展进程。

图3 石斛碱对HuT-78细胞上皮间质转化的影响Figure 3 Effects of DEN on epithelial mesenchymal transition of HuT-78 cells

图4 石斛碱对HuT-78细胞JNK、p38磷酸化表达的影响Figure 4 Effects of DEN on phosphorylation of JNK and p38 in HuT-78 cells

图5 石斛碱和/或SP600125对HuT-78细胞Ki67、cl-caspase-3、MMP-2、p-JNK/JNK表达水平的影响Figure 5 Effects of DEN and/or SP600125 on expression levels of Ki67，cl-caspase-3，MMP-2，p-JNK/JNK in HuT-78 cells

JNK 是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路的一个重要分支，在细胞周期、凋亡和应激等生理和病理过程中起着重要作用。JNK信号通路被上游信号激活后，胞质中的JNK 移位到细胞核，进一步使核内的转录因子c-Jun 氨基末端63/73 位的丝氨酸残基磷酸化，进而启动线粒体依赖的细胞凋亡[19-20]。p38 与JNK 性质相似，同属于应激激活的蛋白激酶。研究表明，JNK/p38参与了上皮间质转化的调控过程，Zhu等[21]发现，通过激活MAPK/JNK/p38信号通路，人卵巢癌细胞的上皮间质转化能力受到明显抑制。那么，石斛碱对人HuT-78细胞存活和转移的抑制作用是否与JNK 信号通路激活相关？本研究结果表明，石斛碱能激活JNK 信号通路，且能部分抵消JNK 抑制剂的干预作用，从而实现对人HuT-78细胞增殖、凋亡和侵袭转移的调节作用。但石斛碱对人HuT-78细胞的作用是否还有其他信号通路的参与，还有待深入研究。

综上所述，本研究以HuT-78 细胞为研究对象，探讨石斛碱对白血病细胞增殖、凋亡和转移的影响及其机制。结果表明，石斛碱可能通过增加JNK 信号通路磷酸化活化水平，实现抑制白血病细胞的存活和转移特性的作用。