牛奶中三聚氰胺检测方法的研究进展

赵 丹

（安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南 安阳 455000）

三聚氰胺（Melamine），化学式C3N3（NH2）3，俗称密胺、蛋白精，国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）命名为1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水（3.1 g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、吡啶等，不溶于丙酮、醚类，对身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。

蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的分子式含氮量约为66%。通用的蛋白质测定方式凯氏定氮法是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，添加三聚氰胺能使生鲜乳中蛋白质含量偏高。使劣质食品通过检验机构的测试。有人估算在植物蛋白粉和饲料中使测试蛋白质含量增加一个百分点，用三聚氰胺的花费只有真实蛋白原料的1/5。三聚氰胺作为一种白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现。

从2007 年上半年中国食品出口质量危机、美国宠物食品污染事件到2008年下半年的中国问题婴幼儿配方奶粉事件，人们始终把目光聚焦在饲料中人为添加三聚氰胺上。随着政府监测商品范围的扩大，逐渐发现即使动物食用未添加三聚氰胺的饲料时，牛奶、鸡蛋中仍会出现三聚氰胺的少量残留，主要原因就是畜禽养殖过程中大量使用了环丙氨嗪（杀虫剂）。环丙氨嗪在动物和植物体内可通过脱烷基作用代谢为三聚氰胺，环丙氨嗪在土壤和环境中的主要物理化学降解方式是光降解，降解产物主要为三聚氰胺。

各个品牌奶粉中蛋白质含量为10%～20%，蛋白质中含氮量平均为16%。以某合格牛奶蛋白质含量为2.8%计算，含氮量为0.448%，某合格奶粉蛋白质含量为18%计算，含氮量为2.88%。而三聚氰胺含氮量为66.6%，是牛奶含氮量的约150 倍，是奶粉含氮量的约23 倍。每100 g 牛奶中添加0.1 g三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白质含量。

中国国家食品质量监督检验中心在2008年9月13日指出，三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的，故暂未设定像农药残留那样的标准限制。2008年10月8日，卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局和国家质量监督检验检疫总局联合发布公告，制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值。2012年7月5日，联合国负责制定食品安全标准的国际食品法典委员会（CAC）为牛奶中三聚氰胺含量设定了新标准，即液态牛奶中三聚氰胺含量不得超过0.15 mg/kg。CAC 曾在2010 年规定，用于制造奶粉的牛奶中三聚氰胺含量最多不得超过1 mg/kg，其他食品中，三聚氰胺含量不得超过2.5 mg/kg。三聚氰胺含量新标准将有助于各国政府更好地保护消费者权益和健康。该文综述了原料乳和饲料中三聚氰胺检测的样品前处理技术和分析方法。

1 样品前处理技术

因为原料乳中三聚氰胺的含量较低，因此样品的前处理是分析工作中至关重要的一步。分析方法的检出限、回收率和准确度都和样品的萃取净化分离程度密切相关。

样品前处理包括三聚氰胺的提取、净化和浓缩。提取是用适当的溶剂将三聚氰胺和样品基质从固相样品中转移到易于净化和分析的液态；净化是指将三聚氰胺与提取液中的干扰基质分离。

液-液萃取是最常用的一种分离萃取技术。其样品处理简单，设备要求低。常用的提取剂有50%乙腈水溶液、甲醇、磷酸盐缓冲溶液等。超声波辅助萃取极大地提高了萃取分离效果。

固相萃取技术是目前常用的净化手段。其原理与液相色谱相似，利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与基体及干扰物质分离后，再用洗脱液将其洗脱，达到分离和富集的目的。三聚氰胺化学结构中含有3 个伯胺集团，在酸性条件下会形成正离子，因而可采用强阳离子固相萃取柱对样品进行净化。

因三氯乙酸有沉淀蛋白的作用，并且在酸性条件下有助于三聚氰胺的溶解，采用1%三氯乙酸作为提取剂，涡旋混匀，超声提取，14 000 rpm/min 离心。取10 ml 上清液备用过（MCX）柱。取3 ml甲醇活化MCX柱→3 ml水平衡→取10 ml提取液过柱→3ml水、3ml甲醇淋洗→3 ml5%氨化甲醇洗脱→50 ℃空气吹干→加入20%甲醇溶液1 ml复溶→过滤供上机分析。

前处理注意事项：①MCX 固相萃取柱或等效者，如PCX、SCX、TCX等。更换柱子时需做柱回收试验，柱回收率90%以上方可使用。②净化时控制过柱速度1ml/min(1滴/2～3 s），活化、平衡及淋洗时可适当加快，但绝对避免液体呈线性流出。③该实验方法称取样品2 g，提取液体积V1为20 ml（牛奶2 g约2 ml+18 ml），净化液体积V2为10 ml，定容体积V3为1 ml，相当于称样2 g，稀释2倍。

2 分析方法

高效液相色谱法（HPLC）是目前应用比较广泛的测定方法之一，较常用的色谱柱有C8、C18柱，检测器有二极管阵列检测器和紫外检测器。因三聚氰胺中含有胺根，具有较强的极性，使其在传统的反相键合相上保留很差，接近于死时间流出，不能进行分析。为了增加三聚氰胺在传统色谱柱上的保留，必须选用洗脱能力非常弱的流动相，通常选用的流动相有水-乙腈、甲醇-水、醋酸铵缓冲溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇等。

由于三聚氰胺极易与C18 柱上残余的硅醇基形成氢键，使峰型拖尾，因此经常将辛烷磺酸钠，庚烷磺酸钠等离子对试剂加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对来改善峰型。我国农业行业标准NY/T1372-2007《饲料中三聚氰胺的测定》也采用了这一办法。有关文献报道在流动相中加入高氯酸可增加三聚氰胺的保留时间并改善峰型，还有采用依次连接两根C18色谱柱的办法，大大延长了分析物的保留时间。该实验使用C8 柱，流动相中离子对试剂缓冲液为柠檬酸和庚烷磺酸钠，流动相调试至色谱图中三聚氰胺出峰位置无杂质干扰。该实验操作最后使用的液相条件：流动相比例是10 mmol/L庚烷磺酸钠、10 mmol/L柠檬酸溶液-乙腈（94∶6）；流速1.0 ml/min；柱温30℃；检测波长240 nm；进样量20 ul。

限量值：婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值1 mg/kg；液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值2.5 mg/kg；含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值2.5 mg/kg，高于限量值的产品一律不得销售。

3 展望

以上叙述的牛奶中三聚氰胺检测方法是目前笔者所在实验室正在用的检测方法，缺点是提取过程不好把握，重现性不好，对于这个检测方法在以后的工作实验中会逐步探索，逐步改进。HPLC法是目前原料乳检测三聚氰胺的常用方法，随着科学技术的发展，分析方法的更新日新月异，简单、快速、高效的检测方法将是众望所归。

食品检测中对三聚氰胺的检测关系到人们的身心健康，人们对其分析方法有更多的期待。检测准确、检测限小、重现性好；技术产品或设备成本较低，运行费用低；适合现场快速检测，是目前对三聚氰胺检测方法的期待，也是将来三聚氰胺检测的研究方向。