临床罕见的类孟买血型检测鉴定(附1例报告)

潘英芳，徐群，孙昌魁，宋永红，李京，吕红娟，周娜，乔文本

山东省血液中心，济南250014

人类血型抗原的编码表达在遗传过程中受多种因素调控，不同程度的突变诱发各种血型变异体及罕见稀有血型的形成。在已发现的39个人类血型系统中，ABO血型系统在临床输血中最为重要，现行的临床输血技术规范，也早已明确规定受血者及供血者的ABO血型为输血必检项目[1,2]。ABO血型鉴定一般采用ABO血型正反定型实验。正定型，又称细胞定型，是指采用定型试剂和被检细胞反应所鉴定出的ABO血型；反定型，又称血清定型，是指用被检者血清和已知ABO血型的试剂红细胞进行的反应所鉴定出的ABO血型。两实验结果判读一致，方可准确定义A、B、O或AB血型，若两实验结果不符则称ABO血型正反定不符，常考虑ABO亚型、罕见稀有血型、室温性不规则抗体干扰或疾病等因素所致。2019年6月，我们发现1例献血者外周血样本的ABO血型正反定型结果不符，血型鉴定困难，随即对其进行基因测序，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 外周血样本及试剂 山东省血液中心检验科送检的献血者外周血样本5 mL，初检献血者ABO血型正定型反应表现为O型，反定型反应表现为A型，ABO血型正反定不符，血型鉴定困难。单克隆抗-A抗体、单克隆抗-B抗体，Ac、Bc、Oc试剂红细胞购自上海血液生物医药有限责任公司，抗人球蛋白试剂、血型不规则抗体筛选细胞、血型不规则抗体鉴定谱细胞、抗-H抗体、抗-Lea抗体、抗-Leb抗体试剂购自荷兰Sanquin公司。

1.2 血型免疫血清学检测方法

1.2.1 ABO血型鉴定 包括正定型和反定型。①正定型：取洁净小试管2支，分别标明抗A、抗B，用滴管分别加入抗A、抗B血清2滴于试管底部，再以滴管分别加入献血者3%～5%的红细胞盐水悬液1滴混匀，以1 000 r/min离心15 s，观察并判读结果。②反定型：取洁净小试管3支，分别标明A、B和O型细胞，用滴管分别加入献血者3%～5%的红细胞盐水悬液2滴于试管底部，再以滴管分别加入A、B和O型3%～5%试剂红细胞悬液1滴混匀，以1 000 r/min离心15 s，观察并判读结果。

1.2.2 红细胞H抗原、Lea抗原、Leb抗原鉴定 取3支洁净试管，分别标注抗-H、抗-Lea、抗-Leb，各管分别加入相应的抗血清试剂1滴和献血者3%～5%红细胞悬液50 μL，3 000 r/min离心15 s，观察并判读结果。

1.2.3 红细胞弱A抗原、弱B抗原、弱H抗原检测 用生理盐水洗涤1 mL献血者红细胞和1 mL O型献血者红细胞3次，移除上清液，分别加入1 mL抗-A抗体试剂、抗-B抗体试剂、抗-H抗体试剂，充分混匀红细胞和抗血清，4 ℃孵育过夜，离心后移除上层抗血清，将红细胞转入干净试管，用4 ℃预冷生理盐水洗涤红细胞6次，留取压积红细胞，加入同等量的生理盐水56 ℃热放散，离心后分离所得的上清液即为放散液。取干净试管，分别加入放散液2滴和1滴试剂Ac细胞、试剂Bc细胞、试剂Oc细胞，离心后观察并判读结果。

1.2.4 不规则抗体筛查和鉴定 取洁净小试管，分别标注Oc1、Oc2、Oc3，加入Oc1、Oc2、Oc3试剂细胞各1滴，再以滴管分别加入献血者血清各2滴，以1 000 r/min离心15 s，观察并记录结果；将上述试管置于4 ℃冰箱中，静置10 min后再次离心，观察并记录结果；再将试管置于37 ℃水浴30 min，取出离心后观察并判读结果；然后洗涤细胞3次，滴加2滴抗人球蛋白试剂，离心后观察并记录结果。

1.3 基因测序 使用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒提取献血者血液基因组DNA，测定其浓度和纯度后，送天津市秀鹏生物技术开发有限公司鉴定其ABO血型基因型并对FUT1基因进行测序。

2 结果

2.1 血型免疫血清学检测结果 ABO血型鉴定结果显示，献血者ABO血型正定型反应表现为O型，反定型反应表现为A型，正反定型结果不符。红细胞H抗原、Lea抗原、Leb抗原鉴定结果显示，献血者红细胞上未检测到H抗原，Lea抗原阴性、Leb抗原阳性，Lewis血型系统定型为Le(a-b+)，初步考虑该献血者血型为孟买血型。红细胞弱A抗原、弱B抗原、弱H抗原检测结果显示，献血者红细胞仅吸收放散出抗-A抗体，推断该献血者血型可能为A型类孟买血型。不规则抗体筛查和鉴定结果显示，在4 ℃与室温条件下，盐水介质中不规则抗体反应均呈阳性；在37 ℃条件下，盐水介质及抗人球蛋白介质均呈阴性，推断该不规则抗体为室温性抗H抗体。

2.2 基因测序结果 献血者ABO血型基因型为AA型。FUT1基因测序结果见图1。由图1可知，FUT1基因第四外显子第658位点发生了C碱基突变为T碱基的改变，即c.658 C>T，且该突变为纯合突变，判断献血者血型为A型类孟买血型。

图1 FUT1基因测序结果

3 讨论

血型是由特异性同种抗体检测的红细胞表面的遗传特性表现[3]，正确的血型鉴定是保证临床安全用血的关键，由于ABO血型抗原的强度是所有人类血型系统抗原中免疫原性最强的，且A、B、O血型个体体内存在相应的抗-A和(或)抗-B抗体，一旦ABO血型鉴定不准确造成ABO错误输血，诱发体内抗原抗体凝集反应即可发生急性或速发型溶血性输血反应，受血者可出现不同程度的寒战、高热、输注无效甚至休克，严重者可危及生命，因此准确的ABO血型定型格外重要，是保证安全有效输血的前提。在临床实践中，我们经常碰见血型鉴定困难的案例，干扰ABO血型鉴定的因素主要归类为：正反定不符、弱抗原的存在、不同试剂鉴定结果难以统一、不规则抗体的存在等。本研究案例综合了正反定不符和弱抗原存在两大难点，我们借助于免疫血清学技术和分子生物学技术准确判定该献血者血型为A型类孟买血型。美国输血协会定义稀有血型是指该血型在人群中的概率为1/1 000，而血型在人群中概率低于1/5 000则称为罕见血型。参照研究统计数据[4]，欧洲人孟买血型、类孟买血型的概率为1/1 000 000，日本人概率为1/15 000，印度人概率为1/10 000，在我国鲜有报道，因此孟买血型及类孟买血型是极为罕见的稀有血型。

1952年，Bhende在印度孟买发现一例H基因缺陷型血型，血清学表现为红细胞表面未检测到A、B、H抗原，同时血清中存在抗-A、抗-B、抗-H抗体，最终将其命名为孟买血型。这是孟买血型首次被发现。1961年，有专家发现1例与孟买血型相似，但红细胞上存在少许A抗原且唾液中可检测到微量H抗原的血型,该血型被定义为类孟买血型[5～7]。针对本例献血者，免疫血清学实验结果显示，红细胞表面未检测到A、B、H抗原，血清中存在不规则抗体，经鉴定为抗H抗体，因此我们初步考虑该献血者为类孟买血型，同时借助于红细胞吸收放散实验，检测出较弱的A抗原表达，因此推论该献血者为A型类孟买血型，这也是山东省在献血者群体中首次发现类孟买血型。

随着研究的不断深入，孟买血型、类孟买血型抗原合成、分泌、表达等一些分子机制也逐渐被揭开[8,9]。调控H抗原编码表达的基因属岩藻糖基转移酶(FUT)家族，其中FUT1、FUT2、FUT3三个基因参与ABH抗原物质的表达。FUT1和FUT2基因有较高的同源性，均位于19q13.33，FUT1基因决定细胞膜上H抗原的表达，FUT2基因决定分泌液中H抗原的表达，而FUT2和FUT3两个基因协同决定Lewis抗原的产生[10，11]。H基因变异存在遗传异质性和基因多态性，当FUT1及FUT2基因发生突变时，可致红细胞膜上和分泌物中均缺乏ABH抗原，此时该血型为孟买血型；当FUT1基因突变失活、FUT2基因正常，可致红细胞膜上ABH抗原缺失，分泌物中尚存在ABH抗原，此时该血型为类孟买血型。目前发现的FUT1突变有60多种，在中国人群中，FUT1基因比较常见的突变种类主要是547-552delAG(即h1型)、880-882delTT(即h2型)，以及近几年发现的658 C>T(即h3型)和35C-T(h4型)[12,13]。考虑到免疫血清学在疑难血型鉴定中存在一定的局限性，我们对该献血者红细胞FUT1基因进行了检测，献血者基因测序结果显示，FUT1基因的658位点C碱基突变为T碱基，符合h3型突变。

研究[14]显示，在FUT2和FUT3基因互相作用下，类孟买血型的红细胞Lewis血型往往表现为Le(a-b+)或者Le(a-b-)。本研究中，我们也对该献血者红细胞Lewis抗原表型进行了检测，结果显示该献血者红细胞Lewis表型为Le(a-b+),符合类孟买血型Lewis血型系统表现型。

临床实践中，常规的血清学ABO血型初筛定型时，类孟买血型样本正定型反应往往表现为红细胞抗原与抗-A/抗-B试剂反应无凝集，而反定型试验血清中一般可以检测到稍弱的抗-A抗体和(或)抗-B抗体，因此，类孟买血型在ABO血型初筛过程中经常被错误的定型为O型。而由于该献血者血清中存在弱抗-H抗体，当该献血者作为受血者输入普通O型红细胞时，可能发生急性输血反应。而作为献血者，该献血者的红细胞及血清一旦输入O型受血者体内，同样会发生不可预测的输血反应[15～17]。因此，针对本例罕见稀有血型献血者红细胞，我们建议将献血者红细胞冰冻保存，一旦同类血型紧急用血时，可以解冻该红细胞，同时我们也联系家属，建议其亲属也进行血型检测，有助于紧急情况下的互助使用。另外，在献血者知情同意的基础上，我们也将其信息编入山东省血液中心临床输血稀有血型库以备不时之需。

综上所述，本研究发现1例临床罕见的A型类孟买血型；对临床鉴定困难且怀疑为罕见类孟买血型的血液样本，在免疫血清学方法鉴定不能明确的情况下，可进行基因检测明确其血型，指导临床用血。随着医疗手段的不断更新，针对疑难血型，借助于常规免疫血清学实验方法的同时，必要时需融入基因检测技术[18]；另一方面，由于电子配血的跟进,人类稀有血型库的建设也迫在眉睫。本例类孟买血型献血者的发现，丰富了山东稀有血型库的多样性[19]。我们呼吁全国血液储备单位，建立互联网稀有血型信息分享机制，包括成立类似RhD阴性稀有血型联盟、组建罕见稀有血型微信群，关键时刻实现无偿互助献血，以便解决稀有血型用血困难的问题。