高低淋巴结转移潜能鼻咽癌细胞与LEC共培养后目标细胞miR-92a-3p表达及其靶基因功能分析

蒋旭，刘琦，张莹，姚茜，3，韦正波，谢莹，3

1 广西医科大学生命科学研究院，广西南宁530000；2 广西医科大学附属肿瘤医院；3 广西区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室

鼻咽癌(NPC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一，在东南亚尤其是中国南方地区高发[1]。早期淋巴结转移是NPC的主要临床特征，局部复发和远处转移是NPC患者预后不良的主要原因。因此，揭示NPC发展过程中淋巴结转移的潜在分子机制具有重要的研究意义和临床价值[2,3]。近年来，肿瘤微环境与肿瘤发生发展尤其是侵袭转移的关系越来越受到学者的重视。NPC起源于鼻咽上皮，由于周围解剖结构的特殊性，局部含有大量的淋巴组织，其中淋巴管内皮细胞(LEC)也是NPC局部微环境中的重要成员之一，LEC与NPC细胞的交互作用在NPC的侵袭和转移中可能起到了非常重要的作用。

本课题组在前期的研究[4]过程中发现，NPC高淋巴结转移细胞株5-8F的条件培养基明显促进LEC的增殖，而LEC的条件培养基促使5-8F细胞的侵袭迁移能力增强，通过两种细胞的共培养可以明显促进细胞的运动和迁移，特别是直接接触共培养尤为明显。为了进一步研究其潜在作用，利用转录组测序技术检测两种细胞在共培养前后转录组水平的表达变化，我们发现miRNA-17-92基因簇在共培养后的两种细胞中均表达改变。miRNA-17-92基因簇是典型的高度保守的多顺反子miRNA簇，位于人类13号染色体13q31.3区域C13orf25的第三个内含子上，编码六个成熟的miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a[5]，miR-17-92基因簇被多数学者认为是一种强效的原癌基因,也是原癌miRNA的典型代表[6]。多项研究[7]表明，miRNA-17-92基因簇的成员在各种疾病中，尤其是在不同类型的癌症中存在特异性表达，提示miRNA-17-92基因簇与多种肿瘤的发生发展密切相关。有研究显示，miR-92a与结直肠癌的淋巴结转移相关，可能是结直肠癌的潜在标志物，而且miR-92a在膀胱癌[8]、结直肠癌[9]、肺癌[10]、宫颈癌[11]、食道鳞状细胞癌[12]中表达增加并促进了肿瘤细胞的转移。因此，为了进一步验证NPC细胞与LEC交互作用下miR-92a-3p表达的改变对NPC淋巴结转移的影响，我们设计了Transwell小室共培养体系，用不同转移潜能的NPC细胞系与LEC进行Transwell共培养，观察miR-92a-3p在共培养前后细胞中表达的差异，并利用生物信息学的方法对miR-92a-3p靶基因进行功能预测，探讨其对NPC淋巴结转移存在的潜在影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人NPC高淋巴结转移细胞株5-8F和人NPC低淋巴结转移细胞株6-10B购自湖南湘雅中心实验室细胞库。LEC购自北京裕恒丰科技有限公司，由美国Sciencell公司构建。DMEM培养基和胎牛血清FBS购自美国Gibco公司，ECM培养基套装购自美国Sciencell公司，青链霉素购自中国Solarbio公司

1.2 细胞培养 5-8F细胞和6-10B细胞分别培养于89%DMEM+10%FBS+1%青链霉素培养基中，LEC在88%ECM+10%FBS+1%ECGS+1%青链霉素培养基中培养，放在37℃、5%CO2的培养箱中进行常规培养。取对数生长期的5-8F细胞、6-10B细胞以及LEC进行常规消化后制成单细胞悬液。

1.3 细胞分组及Transwell共培养 采用0.4 μm孔径的Transwell小室进行细胞共培养，将两种细胞分别接种于上下室，采用6孔板进行单细胞培养，以共培养后的Transwell上室细胞和6孔板培养的单细胞为目标细胞。①在Transwell上室接种1×105个LEC，加入1.5 mL DMEM完全培养基，下室接种1×105个5-8F细胞，加入2.6 mL DMEM完全培养基，记为LEC+5-8F组；在Transwell上室接种1×105个LEC，加入1.5 mL DMEM完全培养基，下室接种1×105个6-10B细胞，加入2.6 mL DMEM完全培养基，记为LEC+6-10B组；在6孔板中接种2×105个LEC，并加入4.1 mL DMEM完全培养基，记为LEC组。②在Transwell上室接种1×105个5-8F细胞，加入1.5 mL DMEM完全培养基，下室接种1×105个LEC，加入2.6 mL DMEM完全培养基，记为5-8F+LEC组；在6孔板中接种2×105个5-8F细胞，并加入4.1 mL DMEM完全培养基，记为5-8F组。③在Transwell上室接种1×105个6-10B细胞，加入1.5 mL DMEM完全培养基，下室接种1×105个LEC，加入2.6 mL DMEM完全培养基，记为6-10B+LEC组；在6孔板中接种2×105个6-10B细胞，并加入4.1 mL完全培养基，记为6-10B组。

1.4 各组目标细胞中miR-92a-3p检测 采用qRT-PCR法。各组细胞培养48 h时，使用miRNA提取试剂盒提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板、以U6为内参，进行Realtime-PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30s，40个循环。以2-ΔΔCt表示细胞中miR-92a-3p的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.5 miR-92a-3p靶基因预测及KEGG通路分析 通过4个miRNA靶基因预测网站miRDB(http://mirdb.org/)、miRTarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu)、miRWalk(http://129.206.7.150/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)预测miR-92a-3p的靶基因，在Venny2.1.0网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取靶基因的交集，即为miR-92a-3p的靶基因。使用KOBAS3.0在线网站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)对4个靶基因预测网站所共同预测的靶基因进行KEGG通路分析，选取P<0.05的通路用RStudio软件作图。

2 结果

2.1 各组目标细胞中miR-92a-3p的相对表达量比较 LEC+5-8F组、LEC+6-10B组、LEC组细胞中miR-92a-3p的相对表达量分别为605.00±119.00、46.30±11.40、1.01±0.16，组间相比，P均<0.05。5-8F+LEC组、5-8F组细胞中miR-92a-3p的相对表达量分别为212.00±39.40、1.00±0.08，组间相比，P<0.05。6-10B+LEC组、6-10B组细胞中miR-92a-3p的相对表达量分别为4.14±0.87、1.02±0.24，组间相比，P<0.05。

2.2 miR-92a-3p的靶基因预测结果 miR-92a-3p的靶基因预测结果见图1。由图1可知，有74个基因被4个miRNA靶基因预测网站共同预测为miR-92a-3p的靶基因，分别是FNIP1、SLC12A5、PTAR1、ZFC3H1、KLHL14、GOLGA3、CPEB3、SLC25A32、SGK3、ZFYVE21、ERGIC2、TECPR2、TRIM36、SYNJ1、RSBN1、ITPR1、MAP1B、PITPNA、ZDHHC5、TMF1、TEF、MOAP1、FAM20C、SOX11、DENND4B、TOB2、PDZD8、GOLGA4、LMBR1L、EVI5、BCAT2、DUSP10、RPL15、TULP4、TNPO1、FAM135A、RORA、YIPF4、PEAK1、WASL、NFYB、TRIO、SLC9A1、DMXL1、PIK3AP1、KLHL11、ATP7A、XYLT2、PER2、ARPC2、BMPR2、MYH9、NUFIP2、SETD5、TSC1、ATP2B4、GALNT7、PDS5B、DBT、IKZF2、SKI、WDR81、NFIB、SMAD7、DNAJC27、ATXN7、EIF4G2、NFATC2IP、TRAM2、UVRAG、AURKA、CREB3L2、GAA、ARFGEF2。

图1 miR-92a-3p的靶基因预测结果

2.3 miR-92a-3p靶基因功能分析结果 miR-92a-3p靶基因KEGG通路分析结果见图2。由图2可知，miR-92a-3p的靶基因富集在TGFβ、PI3k/Akt、AMPK、mToR以及钙信号通路等与肿瘤转移相关的通路上。

3 讨论

自从1889年Stephen Paget[13]提出肿瘤的“种子-土壤”学说以来，肿瘤微环境与肿瘤发生发展特别是转移的关系越来越受到学者们的重视。部分研究也表明肿瘤细胞会通过调节其转移前微环境以达到促进细胞侵袭和转移的作用，而且不同类型的肿瘤具有不同器官或组织的转移偏好，如中国南部地区高发的NPC早期淋巴结转移就是其主要临床特征。NPC发生于患者的鼻咽腔内，其周围微环境中存在着大量的淋巴样组织及淋巴管组织，淋巴管的密度与淋巴结转移密切相关，提示LEC与NPC的侵袭和转移密切相关。LEC在肿瘤的侵袭和转移过程中也起到了极其重要的作用，Pekkonen等[14]将人类黑色素瘤细胞暴露于LEC后使癌细胞更具侵袭性，这些癌细胞移植到小鼠体内后，更容易发生远处器官转移。本课题组前期的研究也发现NPC细胞与LEC的交互作用明显促进细胞的侵袭和迁移，将5-8F细胞与LEC混合后接种，可以使移植瘤小鼠更快的发生淋巴结转移，提示NPC细胞与LEC的交互作用在NPC的淋巴结转移过程中起到了很重要的作用。

图2 miR-92a-3p靶基因KEGG通路分析结果

miRNA是一类小的非编码RNA，可以调节肿瘤的进展，尤其是侵袭和转移的过程。肿瘤转移是一个复杂而低效的过程。为了在远离最初的原发肿瘤部位形成转移，肿瘤细胞需要通过基底膜侵入、渗入血流，通过循环传播，渗透到远端组织或者器官，并适应新的生存和增殖的场所[15]。在每个步骤中，肿瘤细胞与其周围的微环境发生紧密的相互作用。事实上，现在普遍认为，肿瘤细胞的转移潜能是由其内在和外在的关系决定的，而miRNA的作用与调节两者促进转移相关[16]，miRNA可以通过改变癌细胞的内在特性，如细胞增殖、细胞凋亡等，参与肿瘤转移过程。同时，miRNA也可以参与肿瘤转移过程中不同微环境的形成，通过调节肿瘤微环境来调节肿瘤的转移。miR-92a-3p是miR-17-92基因簇的主要成员之一。有研究[12]表明，miR-92a-3p与肿瘤的转移和侵袭密切相关，且是肿瘤发生转移的标志物，如miR-92a前体的转染可以使人食管癌细胞系KYSE410的侵袭和迁移能力增强。miR-92a在非小细胞肺癌组织中高表达，尤其是发生转移的组织中上调更为明显[17]。miR-92a也可以作为结直肠癌的早期淋巴结转移标志物，Jepsen[18]选择T1期伴有(N+)或无(N0)淋巴结转移的结直肠癌患者配对进行miRNA检测，结果发现miR-17-3p和miR-92a-3p在伴有淋巴结转移的样本中明显高表达。为了进一步研究miR-92a-3p在NPC淋巴结转移中潜在作用，本实验选择用两种不同转移潜能的NPC细胞5-8F(高淋巴结转移)和6-10B(低淋巴结转移)分别与LEC共培养，结果发现两种NPC细胞均可以刺激LEC内miR-92a-3p的表达上调，而高淋巴结转移细胞株5-8F的刺激能力明显强于低淋巴结转移细胞株6-10B，我们推测具有不同转移潜能的NPC细胞与LEC共培养后合成miR-92a-3p的能力不同可能与两种细胞不同的转移潜能相关，具有不同转移潜能的NPC细胞可以在肿瘤微环境中调节miR-92a-3p的表达，从而促进NPC的淋巴结转移。

随后，为了进一步分析miR-92a-3p的作用靶点，本研究分别通过miRDB、miRTarbase、miRWalk、TargetScan四大在线工具预测hsa-miR-92a-3p靶基因。这些数据库彼此之间的算法都各不相同，采用不同的数据库同时对目的miRNA进行预测，做交集处理，可得到相对可靠的miRNA靶基因。对这些靶基因进行KEGG信号通路分析发现，这些靶基因富集在TGFβ、PI3k/Akt、AMPK、mToR以及钙信号通路等与肿瘤转移侵袭相关的通路上。综合文献分析，Rao等[19]也证实miR-92a可以靶向亮氨酸重复蛋白磷酸酶(PHLPP2)，从而激活PI3K/Akt/mTOR途径，协助T细胞淋巴瘤(MCL)抵抗化疗诱导的凋亡；而下调miR-92a的表达可以抑制MCL移植瘤小鼠模型中肿瘤的生长。在心血管系统的研究方面发现，miR-92a还参与了内皮细胞损伤、动脉粥样硬化等过程，在氧化应激的状态下胆固醇调节元件结合蛋白SREBP2和miR-92a表达上调，或者通过靶向去乙酰化酶(SIRT1)、Kruppel样因子KLF2和KLF4导致NOD样受体家族热蛋白结合域3炎症因子激活和内源性NO合成酶抑制，导致内皮细胞的功能紊乱[20]。以上研究都提示miR-92a-3p可能参与到肿瘤细胞的多种生物学行为过程中，并对肿瘤微环境的调节起到了极其重要的作用，通过对预测靶点的深入研究将对进一步阐明NPC细胞侵袭与转移的作用机制提供帮助。

总之，我们发现不同淋巴结转移潜能的NPC细胞系与LEC共培养后细胞内miR-92a-3p表达升高，不同淋巴结转移潜能的NPC细胞系与LEC共培养后细胞内miR-92a-3p的表达水平与两种NPC细胞不同的淋巴结转移潜能有关，提示miR-92a-3p可能是NPC发生淋巴结转移的潜在标志物。通过4个在线miRNA靶基因预测网站找到了相对可靠的miR-92a-3p的靶基因,为后续进一步验证miR-92a-3p在NPC肿瘤微环境中调节靶基因的表达，从而影响NPC淋巴结转移提供了数据与理论支持。