大黄素在石墨烯/碳纳米管复合修饰电极上的电化学行为

刘梦琴，向亨芳，曾荣英

(衡阳师范学院 化学与材料科学学院，功能金属有机材料湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421008)

石墨烯是由碳原子组成的六方晶格材料，具有电催化活性高和电子转移速率快等优异的电化学特性，还具有良好的导热性和巨大的比表面积[1-4]。碳纳米管易于吸附和掺杂，能加速物质的电子传递，已被广泛应用分析化学中，包括电化学传感器和生物传感器[5-7]。大黄素(1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌)是从中药虎杖中分离得到的有效成分，在中国传统上用于治疗皮肤烧伤、胆石、肝炎、炎症和骨髓炎[8]，还广泛应用于临床医学上，其有抗肿瘤、抗癌活性，是一种三环共处同一平面的共轭体系，可以嵌入DNA中持续抑制DNA，实现诱导凋亡、抑制癌细胞迁移和增值功能，达到抑制肿瘤细胞生长的效果[9]，还有较好的抑菌能力，应用于多种药物中。近年来，它显示出优越的性能，作为一种新的治疗药物，以减少白血病的影响[10-11]。目前，大黄素的测定方法主要有高效液相色谱法[12-13]、薄层扫描法[14-15]、分光光度法[16]、毛细管电泳法[17]、电化学法[18]等。电化学方法具有操作简单、灵敏度高、实验成本较低等优点，本工作基于石墨烯和碳纳米管导电性强、比表面积大的特点，制备了石墨烯/碳纳米管复合材料，提高了石墨烯的有效比表面积，研究了大黄素在石墨烯/碳纳米管复合修饰电极(GR/MWCNTs/GCE)上的电化学行为，建立了一种测定大黄素的新方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

TECNAIG2F20S-TWIN透射电镜(FEI香港有限公司)；CHI660D电化学工作站(上海辰华有限公司)；SB52000超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；pHS-3C酸度计(上海鹏顺科学仪器有限公司)；三电极系统：GR/MWCNTs/GCE(自制)为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。

大黄素(AR，上海金穗生物科技有限公司)；石墨粉(AR，阿拉丁试剂厂)；多壁碳纳米管(AR，北京博宇高科新材料技术有限公司)。

1×10-3mol·L-1大黄素储备液：准确称量0.006 8 g大黄素固体，用无水乙醇定容到25.00 mL容量瓶中，置入棕色瓶中并置于冰箱中保存。其它试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。

1.2 氧化石墨烯的制备

采用改良的Hummers法[19-20]制备氧化石墨烯。用量筒量取23 mL浓硫酸，冰浴降温至0℃。将0.5 g石墨粉和0.5 g NaNO3加入浓硫酸中，机械搅拌下缓慢加入3 g KMnO4(此时温度控制在5℃以下)，可观察到瓶壁出现绿色。将温度升到35℃，机械搅拌2 h，变成糊状物。控制温度50℃以下，缓慢加入40 mL蒸馏水。继续升温至95℃反应半小时，加入100 mL蒸馏水。搅拌下，分数次倒入20 mL 30%的过氧化氢，得金黄色溶液，趁热抽滤。先用150 mL体积比为1∶10的盐酸溶液洗涤，再用150 mL蒸馏水洗涤，最后将滤饼置入50℃的恒温干燥箱干燥6 h，得黄色的氧化石墨烯固体，取出，装瓶备用。

1.3 GR/MWCNTs复合材料的制备

多壁碳纳米管在浓硝酸中纯化得到短的羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs)[21]。称取0.5 g MWCNT加入200 mL 6.0 mol/L HNO3中，加热回流6 h，蒸馏水洗至中性，得到短的羧基化多壁碳纳米管(MWCNTs)，干燥成粉末备用。称取0.037 5 g GO和0.012 5 g MWCNTs置于250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL去离子水超声分散2 h，然后依次加入1 mL 35%水合肼、7 mL 28%氨水，并于95℃下水浴回流1 h，冷至室温，抽滤，真空干燥，得到石墨烯/多壁碳纳米管复合材料(GR/MWCNTs)[22]，并以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂将其制成2.5 mg/mL的分散液。

1.4 GR/MWCNTs/GCE修饰电极的制备

将玻碳电极用Al2O3粉末抛光打磨成镜面，然后在超声下依次用蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水清洗3 min，自然晾干，备用。用微量注射器取3μL 2.5 mg/mL GR/MWCNTs复合材料溶液，滴至裸GCE上，红外灯烘干，得到GR/MWCNTs/GCE修饰电极。

2 结果与讨论

2.1 石墨烯及GR/MWCNTs复合材料的表征

取适量石墨烯溶液，滴到铜网上，烤干制样，采用透射电镜(TEM)对石墨烯样品的微观结构进行表征。由透射电镜图1A可知，石墨烯呈现平面结构，同时又有大量因石墨烯平面重叠而产生的褶皱，能增大比表面积及与溶液的接触面积，增强其电化学性能。

将石墨烯和碳纳米管复合后，通过透射电镜图1B可以明显看出碳纳米管交错分布在石墨烯表面，因石墨烯在实际使用中易卷曲而导致表面积减小，碳纳米管在石墨烯表面形成网状结构将石墨烯平面结构固定，使石墨烯实际表面积与理论值更加接近，同时石墨烯也是一种优良的导电材料，通过复合，复合材料的导电性显著增大。

图1 透射电镜图Fig.1 TEM image A-TEM image of GO;B-TEM image of GR/MWCNTs

2.2 GR/MWCNTs/GCE在大黄素/PB体系中的循环伏安行为

将GCE、GR/GCE、MWCNTs/GCE、GR/MWCNTs/GCE电极置于10 mL大黄素溶液(1 mL1.0×10-4mol/L的大黄素+2 mL pH=5.00混合磷酸盐(PB)缓冲液+7 mL水)进行循环伏安扫描。由图2可知，大黄素均有一对氧化还原峰，氧化峰在-0.10 V左右，还原峰在-0.65 V左右，在不同的修饰电极下，还原峰电位出现负移，峰电位与峰电流分别为Ep1=-0.558 V，Ip1=8.974μA，Ep2=-0.584 V，Ip2=12.58μA，Ep3=-0.662 V，Ip3=13.00μA，Ep4=-0.616 V，Ip4=32.30μA。复合修饰电极的峰电位与裸电极相比负移0.058 V，复合修饰电极的峰电流是裸电极的3.6倍，说明GR/MWCNTs复合修饰电极具有优异的电催化性能和富集效应。

图2循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammograms Cyclic voltammogram solution:1.00×10-5mol/L Emodin/PB(p H=5.00)；Potential scanning range:-0.8~0V;Scanning rate:100m V/s;1-GCE,2-MWCNTs/GCE,3-GR/GCE,4-GR/MWCNTs/GCE

2.3 测定条件优化

2.3.1 GR/MWCNTs用量的选择

在pH=5.00的PB缓冲溶液中，用GR/MWCNTs/GCE测定1.00×10-5mol/L大黄素。结果表明，随着修饰剂用量的增加，用量为3μL时峰电流最大，本实验选用最佳修饰剂用量为3μL。

图3 GR/MWCNTs复合材料的用量Fig.3 Influence of GR/MWCNTs dosage Cyclic voltammogram solution:1.00×10-5mol/L Emodin/PB(p H=5.00)；Potential scanning range:-0.8~0V;Scanning rate:100mV/s

2.3.2 扫描速率的选择与转移电子数

研究了不同扫描速率下1.00×10-5mol/L大黄素在电极上的循环伏安行为，试验表明，在100~500 mV/s范围内，峰电流随着扫描速率的增大而增大，峰电流Ip(μA)与扫描速率v呈线性关系(插图A)，线性方程为Ip=38.3v+3.204,r=0.980 1，说明此条件下电极反应过程主要是受吸附控制。当扫描速度过大时，峰形变宽，充电电流过大，不利于大黄素的测定。故本实验选择扫描速度为100 mV·s-1。

在峰电位-扫描速率对数值图中(插图B)，峰电位与扫描速率对数值呈良好的线性关系，线性方程为Ep(V)=0.034 5 lnν(V/s)+0.667，r=0.991 8。根据公式Ep=RT ln v/2βnF+k，线性图的斜率应为RT/2βnF。取β=0.6[23]，T=298 K，根据该公式计算的电子数n=0.620 2≈1。

图4 扫描速率的影响Fig.4 The CVs of 10μM Emodin at the GR/MWCNTs/GCE under different scan rates(a→e:100,200,300,400,500mV/s).Inset A is the plot of I p vs.ν;Inset B is the plot of E p vs.lnν

2.3.3 底液pH值的选择与转移质子数

试验了不同p H值的PB缓冲液对峰电流(图5A)和对峰电位(图5B)的影响，结果表明在1.00×10-5mol/L大黄素中，随着底液pH的增加，Ip先增大后减小，在pH=5.00时Ip达到峰值，因此选择pH=5.00的PB缓冲溶液。

分析峰电位-pH相关趋势，结果表明，峰电位与pH呈现良好的线性关系(图5B)，线性方程为Ep(mV)=1065.3-54.7pH，r=0.993 9，根据Ep(mV)=K-59pH，说明反应过程中有H+参与，并且质子转移数a与电子数n相同，即a=n=1，说明大黄素在电极中的反应过程有1个电子和1个质子参与，推测其可能的反应机理为:

图5 p H对大黄素峰电流(A)与峰电位(B)的影响Fig.5 Influence of p H on the reduction peak current(A)and peak potential(B)of emodin.

2.3.4 初始电位的影响

采用线性伏安扫描(LSV)分别试验了初始电位为-0.4，-0.3，-0.2，-0.1，0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 V对峰电流的影响。结果表明，初始电位为0V时，峰值电流最大，试验选用0~-0.8 V的扫描范围。

图6 初始电位的影响Fig.6 Influence of Initial potential on the reduction peak current

2.3.5 富集电位的影响

采用差分脉冲溶出伏安法(DPSV)分别考察了富集电位为-0.6，-0.5，-0.4，-0.3，-0.2，-0.1，0 V对大黄素测定的影响。结果表明，当富集电位为-0.2 V时效果最好，峰电流最大，因此选定富集电位为-0.2 V。

图7 富集电位的影响Fig.7 Influence of enrichment potential on the reduction peak current

2.3.6 富集时间的影响

采用差分脉冲溶出伏安法(DPSV)考察了在最佳富集电位下富集时间对测定的影响，分别测定富集时间为50，100，150，200，250，300，350 s，结果表明，在富集时间为250 s时测定结果最佳。?

图8 富集时间的影响Fig.8 Influence of enrichment time on the reduction peak cur r ent

2.4 电极的重现性与稳定性

用GR/MWCNTs/GCE电极在最佳实验条件下测定1.00×10-5mol/L大黄素，重复测定6次，相对标准偏差(RSD)为1.64%，说明该修饰电极重现性良好。

将新制备GR/MWCNTs/GCE修饰电极置于4℃冰箱中保存，每隔一天重复测定一次，连续测定5次，其氧化峰电流的相对标准偏差(RSD)为4.85%，说明此电极的稳定性较好。

表1 电极重现性实验Table.1 Repr oducibility of GR/MWCNTs/GCE

图9 电极稳定性实验Fig.9 Stability of GR/MWCNTs/GCE

2.5 干扰实验

在最佳实验条件下，考察了常见无机离子与有机物对1.010-5mol/L大黄素测定的影响。实验表明，在允许相对误差±5%范围内，100倍的K+、Na+、NH4+、Cl-、SO42-、NO3-，30倍的维生素B1、抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)，10倍的白杨素等对大黄素测定均无干扰，说明该GR/MWCNTs/GCE修饰电极选择性较好，抗干扰能力较强。

2.6 线性关系与检出限

在最佳实验条件下，采用DPSV进行测定，大黄素还原峰电流与其浓度在1×10-8~1×10-5mol/L内呈现良好的线性关系，其线性回归方程为Ip(μA)=1.1285c(μmol/L)+4.7699，r=0.992 9，检出限(S/N=3)为1.1×10-9mol/L。

图10 不同浓度大黄素的差分脉冲伏安图；内插图表示Ip与大黄素浓度的关系Fig.10 DPSV of Emodin for the different concentration at GR/MWCNTs/GCE;Inset is the plot of Ip vs.CEmodin.Testing potential:0~-0.8V;scanning rate:100 mV/s;rest time：4s;Enrichment potential:-0.2V;Enrichment time:250s

2.7 样品及回收率测定

准确称取大黄粗粉10 g于250 mL圆底烧瓶中，加30 mL无水乙醇，沸水浴中回流2 h，趁热过滤，滤液静置2 h，抽滤得沉淀，将沉淀提取物用乙酸乙酯溶解，用5%Na2CO3溶液萃取数次，合并萃取液，加10%盐酸至酸性得橙黄色沉淀，用冰乙酸重结晶，得到大黄素纯化品。

准确称取大黄素纯化品0.01~0.02 g，置100 mL容量瓶中，加乙醇溶解，定量摇匀。移取一定量的样品溶液分别置于100 mL容量瓶中，分别加入大黄素标准溶液(1.0×10-4mol/L)1，2，4，5 mL。按实验方法进行加标回收率实验，测定结果列于表2，大黄素素的回收率为96.0~103.0%，相对标准偏差(RSD)为1.7~3.5%。

表2 样品分析结果及回收率Table.2 Determination results of emodin in samples and recover ies

3 结论

本实验以GR和MWCNTs为修饰剂，制备GR/MWCNTs/GCE复合修饰电极。在最佳实验条件下(缓冲液pH=5.00，扫描速率100 mV/s，富集时间250 s)，GR/MWCNTs/GCE复合修饰电极对大黄素有良好的电催化能力，电极的重现性和稳定性好，还原峰电流与大黄素浓度为1×10-8~1×10-5mol/L时有良好的线性关系，检出限(S/N=3)为1.1×10-9mol/L。该法的灵敏度高，操作方便、快速，复合材料性能稳定。测定大黄药材中的大黄素回收率为96.0~103.0%，相对标准偏差(RSD)为1.7~3.5%，为大黄素的痕量分析提供了一种新方法。