张浩然 徐 汀 张亦菲 田 恺 华贤辉 黄家莺*(上海市兽药饲料检测所,上海201103)
25- 羟基维生素D3(25-OH-D3),是维生素D3在机体内的首个代谢产物,更易被吸收[1]。目前,25-OH-D3已广泛用于畜禽养殖业,用于提高蛋壳质量[2]、提高母猪怀孕率及窝产仔数[3-4]等。目前关于饲料中25-OH-D3含量测定的报道仅限于配合饲料及浓缩饲料[5-6],至于预混合饲料方面,仍为空白。此外,维生素预混合饲料中25-OH-D3的含量高,用量大,又是配合饲料和浓缩饲料中25-OH-D3的来源。因此,本文建立了维生素预混合饲料中25-OH-D3含量测定的方法以期为维生素预混合饲料的质量控制提供技术手段。
1.1 仪器和试剂高效液相色谱仪(ACQUITY Arc,Waters 公司);电子天平(AB265-S,梅特勒- 托利多公司,精度为0.01 mg)。25-OH-D3标准品(Dr. Ehrenstorfer 公司,纯度为98.2%,批号为G155330);甲醇为色谱纯;试验用水为一级水;维生素预混合饲料样品来自于市场收集。
1.2 色谱条件采用Thermo AQUASIL-C18色谱柱(规格为100 mm×3.0 mm,粒径3 μm),检测波长为264 nm;50 μL进样;柱温箱温度为30℃;流动相:A 相为水,B 相为甲醇,梯度洗脱程序见表1。
1.3 试样溶液的制备称取维生素预混合饲料3 g 置于50 mL 棕色容量瓶中,加水10 mL,超声10 min,冷却;继续加入30 mL 甲醇,混匀,超声提取20 min,冷却,用甲醇定容,稀释至刻度,摇匀;移取20 mL 于离心管中,离心5 min(6000 转/min)取上清,过0.22 μm 滤膜,得到试样溶液。
1.4 标准储备溶液的制备称取25-OH-D3标准品25 mg,置于25 mL 棕色容量瓶中,加入适量甲醇,振摇使25-OH-D3溶解,用甲醇定容。于-20℃保存。
1.5 标准系列溶液制备移取标准储备溶液适量,用85%甲醇溶液逐级稀释至棕色容量瓶中,使浓度分别为25 μg/mL,10 μg/mL,5 μg/mL,1 μg/mL,0.5 μg/mL,0.05 μg/mL。
2.1 方法的线性与范围以浓度(x)为横坐标,相应峰面积(y)为纵坐标,绘制标准曲线。得到线性方程为y = 133964x -11009,相关系数为0.9998。结果表明,本方法在0.05μg/mL~25 μg/mL 浓度范围内,线性良好。
2.2 方法的检测限和定量限向空白基质中添加25-OH-D3对照品,按照本文1.3 前处理后,以信噪比大于等于3 的浓度作检出限,信噪比大于等于10 的浓度作定量限,确定了本方法的检出限为0.2 mg/kg,定量限为1 mg/kg。
表1 梯度洗脱表
2.3 方法的准确度和精密度以空白基质添加的方式,从50 mg/kg、150 mg/kg、300 mk/kg 三个不同浓度考察方法的准确度及精密度。结果表明,各浓度添加的回收率在87.9%~94.2%之间,RSD 在0.6%~2.2%之间结果见表2。
表2 方法准确度及精密度的试验结果(n=5)
表3 实际样品测定结果数据表(n=3)
2.4 样品测定采用本法对各类维生素预混合饲料样品进行测定。为确保结果准确,对各样品进行了本底浓度的加标。结果表明,维生素预混合饲料的测定结果在32.5 mg/kg ~220.8 mg/kg 之间,本底加标回收率在86.6%~94.8%之间,说明本法适用于维生素预混合饲料中25-OH-D3的含量测定,结果见表3。
上述结果表明,本方法线性良好,具有较好的准确度及精密度,可用于测定维生素预混合饲料中25-OH-D3的含量。