再生水灌溉对小麦抗氧化酶基因表达的影响

张 蕾，楼春华，李 艳，马 宁

（1.北京市水科学技术研究院，北京100048；2.扬州大学现代农村水利研究院，江苏扬州225009）

我国人均水资源量极度匮乏，再生水的有效利用能够缓解水资源紧张的压力。再生水灌溉是指将生活污水和工业废水无害化处理后，用于农业灌溉、园林灌溉等。再生水灌溉可以充分提高水资源的利用率，有效减轻淡水资源的过度开采压力。但同时，再生水与新水仍然存在明显差异，再生水中有机物和重金属等成分可能会对土壤和植物产生影响[1]。

《北京市中长期科学和技术发展规划纲要（2008—2020 年）》在“发展资源综合利用技术，建设资源节约和环境友好型城市”主题中重点要求“集中突破再生水安全回用、雨洪水资源化利用以及海水淡化关键技术，实现资源化开发利用，增加可利用水资源总量”。据统计，2018 年，北京市全年用水量39.30 亿m3，再生水利用量为10.76 亿m3，再生水利用潜力仍有充分挖掘的空间。

已有研究表明，再生水灌溉处理与清水灌溉处理相比，小麦产量没有显著变化。再生水灌溉条件下，小麦籽粒中的主要品质相关指标含量（可溶性总糖、粗蛋白、粗淀粉、粗灰分、还原性Vc 等）均未受到显著性影响；同时，小麦籽粒中全氮的质量分数平均增加10.2%，而全磷和全钾含量则没有明显变化[2]。有研究也表明，再生水灌溉在一定程度上能够提高氮的利用效率[3]。

基于再生水与新水的差异，再生水中重金属等物质的富集对植物生长环境而言可以看作是逆境。逆境是指不适合植物正常生存和生长的各种环境因素，长时间的逆境作用于植物体即会造成胁迫；持续在逆境中生长，植物体内会产生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。活性氧是指化学性质活跃的含氧原子或原子团，主要有过氧化氢（H2O2）、超氧根离子（O2-）等。少量的ROS 能够参与多种细胞机制，在植物生长代谢中发挥积极作用；而在正常生长条件下，ROS 能够维持在一个相对稳定的水平，多余的ROS 能够通过植物体内多种防御消除机制进行清除[4]。但是，当植物处于逆境生长条件时，ROS 的产生与消除机制之间的平衡关系被打破，造成ROS 含量急增[5]；而ROS 长时间的积累，会造成细胞内DNA、碳水化合物、蛋白质和脂类等物质结构被破坏，对细胞造成严重损伤[6]。

植物体内具有多种酶促清除系统反应来调节多余的ROS，以适应胁迫条件。酶促清除系统主要包括抗坏血酸过氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物还原酶（PrxR）等多种酶类。其中，APX 是以抗坏血酸（AsA）为电子传递体，通过抗坏血酸- 谷胱甘肽（AsA-GSH）循环过程清除H2O2，并生成单脱氢抗坏血酸（MDAsA），清除过程与氧化型辅酶Ⅱ（NADP）还原过程相偶联。对ROS 酶促清除系统的研究发现，在对逆境胁迫的响应过程中，APX 伴随其他比如SOD、CAT 等酶类活性明显增强[7-8]。

在对玉米的研究中发现，与清水灌溉相比，玉米用二级再生水灌溉后，抗氧化酶系统会受到一定影响；用三级再生水灌溉后，抗氧化酶系统受到的影响并不显著。对大豆的研究表明，在苗期和收获期，用再生水灌溉后，大豆抗氧化酶系统受到影响较小；但大豆花期，再生水灌溉却对生长产生了较强的氧化胁迫作用[9]。

目前，对再生水灌溉小麦的研究主要集中在产量与品质、典型污染物富集及健康风险评价等方面，而对于再生水灌溉下植物细胞内分子生物学方面的研究相对较少。

本研究通过对小麦根部抗氧化酶活性及相关反应物等指标进行测定，研究再生水灌溉下植物响应机制，旨在为再生水灌溉的应用与推广提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试作物为冬小麦，小麦品种为论选518。

1.2 试验设计

试验地点选在北京市通州区永乐店某试验基地。该试验基地海拔12 m，位于北纬39°20′、东经114°20′。冬小麦试验期间为10 月至第2 年6 月，播种时施底肥磷酸二铵250 g/小区，行距15 cm。设置3 个处理：CK.清水灌溉；ZT.再生水灌溉；JT.清水和再生水2 种水源交替灌溉。每个处理3 次重复，试验所用测坑均为无底，规格为3 m×2 m，面积6 m2。不同品种之间灌溉制度相同，具体灌水情况如表1所示。

表1 冬小麦试验灌溉制度

其中，试验所用清水取自当地地下水，再生水来自高碑店污水处理厂二级出水。经检测，灌溉所用的再生水水质指标基本符合《城市污水再生水利用农田灌溉用水水质》（GB 20922—2007）中基本控制指标，指标包括pH、悬浮物（SS）、化学需氧量（CODcr）、生化需氧量（BOD5）、重金属等。水质测定结果如表2 所示。

表2 灌溉用再生水水质指标

1.3 测定项目及方法

1.3.1 材料获取 小麦取样时间选在灌浆期和收获期。从每个小区中选取位置居中、长势均匀的数株小麦植株，将其根部从土中轻轻取出，快速剪断并收集主根部，用铝箔纸包裹，避免二次污染，液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱待测。其中，收获期根部样品仅用于测定酶基因表达量。

1.3.2 酶基因表达量测定 APX 酶和SOD 酶基因表达量测定采用Real-time PCR 技术。以小麦根部样本作为RNA 提取材料，反转录得到cDNA。

RT-PCR 引物由Primer 5.0 软件设计，包括APX-RT-F（ATGGACTCGTGACCCTCTGA）和APXRT-R（GGATCATCCAACAATGCCTT）以 及SODRT-F（GAAAAAGTGCTTGCGTGATT）和SOD-RTR（ATATACAAAGATCCAACAGCGG）。反应体系10 μL：包括SYBR FAST Qpcr Kit Master Mix（Universal）5 μL，正反引物各0.2 μL，cDNA 模板1 μL，ROX 校正染料0.2 μL，ddH2O 3.4 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性3 s，60 ℃退火20 s，40 个循环，每一个循环的退火阶段对荧光进行实时检测；95 ℃反应15 s；60 ℃反应15 s；95 ℃反应15 s。这个过程记录荧光信号变化，从而得出扩增产物的溶解曲线。每个样品重复3 次，根据标准曲线计算测定结果与校正值，并计算平均值。对基因表达量的测定选用相对定量法（指在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化，本研究以清水灌溉下基因表达量为基准，对不同灌溉方式处理的样本中的基因表达水平进行比较）。本次分析选用β-actin 作内参基因，对目的基因的表达量进行校正。相对定量方法选择常用的2-ΔΔCt法。

1.3.3 其他生化指标测定 丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、过氧化氢（H2O2）、谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量测定采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒进行。NADP/NADPH 值的测定采用EnzyChrom NADP/NADPH Assay Kit（BioAssay）进行。

1.4 数据处理

数据整理和作图分别采用WPS 和SigmaPlot 14.0 软件进行。

2 结果与分析

2.1 再生水灌溉对小麦根部细胞基本应答的影响

丙二醛（MDA）通常用于表示细胞膜过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。从图1 可以看出，与清水灌溉相比，再生水灌溉后，小麦根部细胞膜透性发生改变，灌浆期细胞内MDA 含量增高，ZT处理（再生水灌溉）下根部细胞内MDA 的含量为CK 的1.13 倍，JT 处理（清水与再生水交替灌溉）下根部细胞内MDA 的含量为CK 的1.09 倍。

脯氨酸（Pro）含量通常用于反映逆境对植物的损伤程度和植物对逆境的抵抗力。从图1 可以看出，再生水灌溉后，小麦根部Pro 含量在灌浆期较清水灌溉（CK）和JT（清水与再生水交替灌溉）处理略高，分别高3.69%和3.74%。Pro 含量越高，表明植物体内渗透调节越强，通过提高Pro 含量来减少在逆境胁迫中所受的损伤，同时也表明植物响应逆境的渗透调节水平提高。

2.2 再生水灌溉对小麦根部H2O2 含量的影响

植株在逆境生长时，机体内会产生大量的ROS，而H2O2为其中一种主要的活性氧。由图2 可知，与CK（清水灌溉）和JT 处理（清水与再生水交替灌溉）相比，ZT 处理（再生水灌溉）条件下，小麦根部H2O2含量较低，为CK 的92.12%，而清水与再生水交替灌溉与清水灌溉之间没有明显差别。结果表明，再生水灌溉下，小麦根部清除了更多的H2O2。

2.3 再生水灌溉对小麦根部抗氧化酶基因表达的影响

从图3 可以看出，ZT 处理（再生水灌溉）下，在灌浆期和收获期，小麦根部清除H2O2的主要酶类APX 表达均明显增加；将CK 处理（清水灌溉）下APX 基因表达改变倍数（2-ΔΔCt）设为1，灌浆期ZT处理（再生水灌溉）下APX 基因表达量是CK 的2.25 倍，JT 处理（清水与再生水交替灌溉）下APX基因表达量是CK 的1.35 倍；收获期ZT 处理（再生水灌溉）下APX 基因表达量是CK 的1.51 倍，JT 处理（清水与再生水交替灌溉）下APX 基因表达量是CK 的1.25 倍。

SOD 作为清除ROS 的另一种重要酶类，再生水灌溉后也发生了变化。将CK 处理（清水灌溉）下SOD 基因表达改变倍数（2-ΔΔCt）设为1，灌浆期ZT处理（再生水灌溉）下SOD 基因表达量是CK 的1.56 倍，JT 处理（清水与再生水交替灌溉）下SOD基因表达量与CK 基本持平；收获期ZT 处理（再生水灌溉）下SOD 基因表达量是CK 的1.41 倍，JT 处理（清水与再生水交替灌溉）下SOD 基因表达量是CK 的87.82%。

2.4 再生水灌溉对小麦辅酶蛋白含量的影响

由单脱氢抗坏血酸（MDHA）生成AsA 的过程就是以还原型辅酶Ⅱ（NADPH）为电子供体生成氧化型辅酶Ⅱ（NADP）的过程；由脱氢抗坏血酸（DHA）生成AsA 的过程就是以还原型谷胱甘肽（GSH）为底物生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）的过程。机体对逆境的响应过程会消耗大量的AsA，其再生过程会引起氧化型与还原型辅酶蛋白含量比值的变化。由图4 可知，ZT 处理（再生水灌溉）下，小麦根部NADP/NADPH 的值略高于CK 和JT 处理（清水和再生水交替灌溉），而ZT 处理（再生水灌溉）和JT 处理（清水与再生水交替灌溉）下，小麦根部GSH/GSSG 的值均明显低于CK，分别为CK 的74.65%和79.79%。

3 结论与讨论

逆境条件引起的胁迫会产生大量的ROS，从而对植株造成损伤[10]。植物在逆境中受损伤的主要部位之一是细胞膜[11]。本研究发现，再生水灌溉和清水与再生水交替灌溉下，根部细胞内MDA 含量均高于清水对照。而Pro 含量，再生水灌溉较清水和清水与再生水交替灌溉略高。结果表明，再生水灌溉条件对植物来说存在与清水不同的逆境响应。

植物遭遇逆境时会造成ROS 积累，H2O2是植物体内主要的ROS，其含量可以反映植物受胁迫损伤的程度[12-13]。本研究结果表明，再生水灌溉下，灌浆期植物根部H2O2含量较清水和清水与再生水交替灌溉要低。对抗氧化酶APX 和SOD 的基因表达研究结果表明，再生水灌溉下，小麦APX 和SOD 基因表达均较清水灌溉有所增强。通过对比灌浆期和收获期基因表达差异发现，与清水灌溉相比，再生水灌溉下APX 基因表达量在灌浆期高于收获期，而交替灌溉下APX 基因表达量在2 个生长期增加量相近，均低于再生水灌溉。SOD 基因表达方面，再生水灌溉下表达增强，而清水与再生水交替灌溉下其表达量没有出现增加趋势，反而在收获期略有下降。本研究结果表明，小麦根部APX 基因在再生水灌溉下，先在灌浆期出现明显增强响应，在再生水持续灌溉下，这种增强反应逐渐降低，植物表现出逐渐适应再生水灌溉条件，而SOD 基因表达与APX 基因同步增强。

AsA 的再生过程在植物抗逆响应中起到非常关键的作用，对酶促清除系统持续消除过量H2O2的能力必不可少[14-15]。APX 消除H2O2的过程，以AsA作为电子供体，将H2O2还原成H2O，同时AsA 被氧化形成单脱氢抗坏血酸（MDHA）。而MDHA 在单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）的作用下，一部分被还原成AsA，这部分AsA 则可以再次参与H2O2的清除过程；另一部分MDHA 被氧化，形成了脱氢抗坏血酸（DHA），在脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的作用下，DHA 又生成AsA，这一过程以还原型谷胱甘肽（GSH）为底物，反应后产生氧化型谷胱甘肽（GSSG），在谷胱甘肽还原酶（GR）催化下生成GSH。综上所述，H2O2的消除过程，与NADP/NADPH和GSH/GSSG 这2 个氧化还原对相偶联，以维持细胞内正常的氧化还原环境[10，16]。本研究表明，再生水灌溉下NADP/NADPH 的值变化不明显，而再生水灌溉下GSH/GSSG 的值比清水明显下降，清水与再生水交替灌溉条件下降幅居中，结果表明，以GSH为底物生成AsA 的过程对再生水灌溉条件的响应更强。

据报道，水稻[17]、大豆[18]、玉米[19-20]、茄子[21]等多种植物在遇到胁迫逆境时，会表现出形态上和生理上的适应性。通过本研究试验结果得到证实，再生水灌溉的逆境胁迫刺激植物体内H2O2的生成，但酶促清除系统内APX 基因等能够减轻ROS 对植物造成的损伤。

植物适应逆境条件生存是一个极为复杂的调控过程，本研究结果可为再生水灌溉的机制研究与应用提供一定科学依据。