雨生红球藻植物类型隐花色素基因克隆与序列分析

杭 伟，张宏江，马浩天，王晓丹，许文鑫，赵春超，李润植，崔红利

（山西农业大学分子农业与生物能源研究所，山西太谷030801）

光照是植物生长的能量来源，也是介导植物光形态建成和生物节律的环境影响因子。CASPARY研究发现，光照条件下东爪草（Tillea aquatica）种子的发芽率达到最高[1]。BORTHWICK 等[2]研究发现，640～670 nm 红光（R）能有效促进莴苣种子萌发，而720～750 nm 远红光（FR）则抑制莴苣种子萌发。低剂量的紫外光UV-B（290～300 nm）影响植物下胚轴伸长、子叶伸展、叶片光合作用和生物节律[3-4]。

光合作用的生物在进化的过程中获得了复杂而又精细的光感知和转导信号通路，其中，光受体在这个信号通路中发挥着重要的作用[3-4]。植物细胞内分布着大量感知光信号的光受体蛋白。根据不同波长的光谱，将光受体分为3 类光受体：感受红光/远红光（600～750 nm）的3～5 种光敏色素受体（PHYs），感受蓝光和UV-A（390～500 nm）的8 个蓝 光 受 体（CRY1、CRY2、CRY-DASH、ZTL、FKF1、LKP2、PHOT1、PHOT2），感受紫外UV-B（280～315 nm）的1 个紫外光受体UVR8[5-7]。有关光受体功能和信号转导通路的研究是近年来光化学和光遗传学研究的热点领域[8-9]。

隐花色素（CRYs）是属于隐花色素/光裂解酶（cryptochrome/photolyase，CPF）基因家族，广泛分布于动物、植物、藻类[10]，能被蓝光激活的受体蛋白，具有调控植物光形态发生和生物节律的功能[11]。隐花色素最早在双子叶植物拟南芥中被发现[12]。在拟南芥当中，隐花色素主要分为3 类：CRY1、CRY2、CRY-DASH。CRY1 和CRY2 主要是植物感受外界光信号的光受体，参与调控植物光周期开花和植物光形态建成过程；CRY-DASH 具有修复由光造成的ssDNA 和dsDNA 损伤的能力[13]。高等植物关于隐花色素的研究较多，在番茄（Lycopersicon esculentum）、大豆（Pisum sativum）、玉米（Zea mays）等高等植物上研究也较多[14-16]。在真核藻类当中，关于藻类中隐花色素的研究较少。绿藻莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhartii）和团藻（Volvox carteri）中，分别存在4 个CRYs，一个植物类型（CPH1）、一个动物类型（aCRY）和2 个DASH 类型[17-18]。在蓝关和红光条件下，发现莱茵衣藻的动物类型隐花色素（aCRY）与调控细胞周期循环、节律调节、叶绿素及类胡萝卜素合成等关键基因在转录水平上相关联。随着转录组和基因组数据的公开，在海洋真核绿藻（Ostreococcus tauri）中发现动物类型CRY（aCRY）[19-20]。

雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一株高产虾青素的单细胞真核绿藻，在胁迫条件下虾青素含量可达到细胞干质量的4%[21]。相关研究表明，在蓝光条件下，雨生红球藻合成虾青素相关基因高表达，虾青素大量积累[22]。但是，这些基因被激活的作用机制尚不清楚。研究表明，在高等植物中，CRYs 光受体介导信号通路可调控植物体内类胡萝卜素合成[23-24]。但目前，尚未见雨生红球藻中CRYs的克隆及功能研究相关报道。

本试验以真核绿藻雨生红球藻为研究对象，采用同源克隆的方法克隆雨生红球藻植物类型CRY基因cDNA 序列，并对序列进行生物信息学分析，为Hae-P-CRY 基因的表达、功能、信号转导通路及互作蛋白的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 试验所用雨生红球藻藻株Flotow 1844 购自藻类和原生生物培养中心，由山西农业大学分子农业与生物能源研究所藻种库保存。培养条件为：光照强度25 μmol/（m2·s），温度（22±1）℃，采用BG 11 液体[25]培养基于光照培养箱中培养。光周期设置为12 h/12 h 的光/暗周期。本试验用LB 培养基培养大肠杆菌TOP 10。LB 培养基成分，包括10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母萃取物，10 g/L NaCl，用5 mol/L NaOH 调至7.0～7.2，定容，高压灭菌15～20 min。LB 固体培养基是在液体培养基基础上加入1.5%的琼脂。

1.1.2 试剂 提取RNA 的试剂盒、反转录试剂盒、RACE 试剂盒、PCR 试剂盒、DNA 片段回收试剂盒及测序载体（PMD-18T）等均购买于Takara 生物公司，琼脂糖购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 仪器 SW-CJ-2D 超净工作台（上海博讯医疗生物仪器有限公司）、GTOP 光照培养箱（浙江托普仪器有限公司）、DYCP-31BN 核酸电泳仪（昆山广测仪器设备有限公司）、VeriFlexTM 96 PCR 仪（上海爱测电子科技有限公司）、GelDox XR Bio 凝胶成像仪（上海艾研生物科技有限公司）、小型低温高速离心机（上海继普电子科技有限公司）、Nano Drop 2000 分光光度计（赛默飞世尔科技公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA 的提取 采用Takara 公司的RNA提取试剂盒，具体过程参考产品说明书，提取后的RNA 于-80 ℃保存。

1.2.2 模板的制备 包括普通cDNA 模板的制备和RACE 模板制备两大类。普通模板的制备参照Takara 公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser 的cDNA 制备试剂盒说明书进行，包括基因组DNA 处理和反转录2 步。RACE 模板的制备参照Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplication Kit 的RACE 试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 引物设计 在比较基因组学分析的基础上，根据与雨生红球藻物种相近的4 株绿藻物种，分别为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhartii）、团藻（Volvox carteri）、小球藻（Chlorella vulgaris）和胶球藻（Coccomyxa sp.C-169）隐花色素CRY 基因序列比对的结果，找出高度保守的氨基酸序列，用CODEHOP软件设计兼并引物。根据同源克隆片段设计RACE引物，在获得全长的基础上设计表达框引物（表1），引物合成由上海生工生物工程公司完成。

表1 试验所用引物序列

1.2.4 同源片段的获得 以1.2.2 中制备的普通cDNA 为模板，结合设计的同源克隆引物，采用Takara 公司的Takara LA TaqR扩增体系进行PCR扩增。PCR 反应条件为：94 ℃5 min，1 个循环；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃60 s，30 个循环；72 ℃7 min，4 ℃保温。循环结束后，取3 μL PCR 产物，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据引物位置确定目的条带的大小，将可能的目的条带进行回收，进行后续的连接、转化及测序。

1.2.5 cDNA 全长的获得 在获得同源片段的基础上，设计RACE 引物（表1），以1.2.2 中制备的RACE cDNA 为模板，根据试剂盒说明书进行两段片段的PCR。产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测、连接、转化及挑选阳性克隆测序。

1.2.6 生物信息学分析 Hae-P-CRY 基因cDNA全长序列通过软件SeqMan software of DNAStar 7.1（DNASTAR Inc.，USA）拼接得到；序列翻译和ORF的查找借助在线软件（http：//www.bio-soft.net/sms/）进行。利用Clustal W 软件[26]进行多序列比对分析。目的基因翻译氨基酸的分子质量、等电点（pI）和理化性质采用ExPASy Compute pI/Mw tool 软件预测。结构域分析通过在线SMART 和Pfam 软件进行[27]，利用PhyML 中的ML（Maximum likehood）法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 雨生红球藻总RNA 提取

获得的总RNA 通过凝胶电泳进行完整性的检测，从图1 可以看出，出现3 种条带，从上到下分别为28S、18S、5.8S rRNA，说明RNA 质量较好，较为完整。通过NanoDorp 2000 微量分光光度计检测，A260/A280在1.8～2.0，满足试验要求。

2.2 雨生红球藻Hae-P-CRY 基因cDNA 序列的获得

通过同源克隆和RACE 相结合的方法，获得了雨生红球藻中编码隐花色素基因的cDNA 序列（Hae-P-CRY，NCBI 注册号：MN073493）的全长。cDNA 全长3 608 bp，开发阅读框2 988 bp，编码区长度1 884 bp，编码995 个氨基酸（图2），5′- 非翻译区（5′-UTR）长度为294 bp，3′- 非翻译区（3′-UTR）长度为198 bp，并带有poly（A）尾巴。通过Blast P程序分析，氨基酸序列与莱茵衣藻来源CRY 的相似性达到66.6%。

2.3 雨生红球藻Hae-P-CRY 的理化性质分析

利用ProtParam 软件分析Hae-P-CRY 基本理化性质。开放阅读框翻译的氨基酸预测分子质量为107.7 ku，预测等电点为6.19。由20 种氨基酸组成，构成了总数为627 个氨基酸的蛋白，含量较高的氨基酸是丙氨酸（Ala，12.3%）、甘氨酸（Gly，9%）和脯氨酸（Pro，8.2%），含量较低的氨基酸是丝氨酸（Ser，8.0%）。其中含有人体内必需氨基酸，如赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸等。

2.4 雨生红球藻Hae-P-CRY 的二级结构分析

通过PORTER 软件分析（图3），获得Hae-PCRY二级结构主要包括：α- 螺旋、β- 折叠、延伸链和无规则卷曲。其中，无规则卷曲所占比例最高，为48.94%；α- 螺旋、β- 折叠和延伸链分别占到35.08%、6.73%和9.25%。可以判定，Hae-P-CRY蛋白属于混合型蛋白。

2.5 雨生红球藻Hae-P-CRY 结构域和序列比对分析

利用SMART 和CDD 软件分析了Hae-P-CRY中的保守结构域，结果表明，存在与Hae-P-CRY蛋白相关的结构域有脱氧核糖二嘧啶光裂解酶（Deoxyribodipyrimidine photolyase）和脱氧核糖核酸光解酶（DNA photolyase）相关结构域。运用Clustal W软件对Hae-P-CRY氨基酸序列与高等植物、藻类的隐花色素进行了多序列比对分析。从图4 可以看出，图中的阴影面积较多，表明Hae-P-CRY 基因编码的蛋白序列在不同植物和藻类中高度保守。在N端存在典型的保守光裂解酶（PHR）结构域，含有辅基MTHF 和FAD，主要负责光感知功能。

2.6 雨生红球藻Hae-P-CRY 的起源和系统进化分析

通过NCBI 库Blast P 比对分析发现，高等植物和部分藻类都存在隐花色素（CRY）。可见，CRY 分布较广。为了进一步研究不同物种来源CRY 起源和系统进化，本研究运用MEGA 5.0 软件将Hae-P-CRY与其他植物、细菌和藻类隐花色素的蛋白序列进行聚类分析，结果如图5 所示。进化树结果表明，聚类分为4 种：6-4 光裂解酶、CRY-DASH、CPD、植物型CRY。目的序列Hae-P-CRY与绿藻纲莱茵衣藻亲缘关系最近，并且与模式植物拟南芥植物型CRY 聚为一支，同属于植物类型CRY。它们之间在进化关系上可能存在共同的祖先。

3 讨论

光不仅为真核微藻提供能量，而且作为重要的信号因子之一为它们提供信息，调节其生长发育过程[28]。真核微藻在漫长的进化过程中形成了一套精细而又复杂的光信号感知和转导系统。细胞光感知与体内其他信号转导途径相耦联，共同调控多种生理过程。例如，高等植物拟南芥和模式绿藻莱茵衣藻中CRYs 的研究表明，CRYs 参与感知蓝光同时调控多种生理过程的信号通路，为雨生红球藻中研究CRYs 的功能提供了线索[12，17]。

通过同源克隆和RACE 结合方法获得了雨生红球藻中编码植物类型隐花色素（Hae-P-CRY）基因的cDNA 序列全长。Hae-P-CRY蛋白序列与拟南芥来源AtCRY 的相似性达到46.94%，与莱茵衣藻来源CreCRY 的相似性达到66.6%，暗示该基因可能是雨生红球藻中可能的编码植物类型隐花色素的基因。隐花色素蛋白由N 端氨基酸序列与光合裂解酶（Photolyase-homologous region）N 端氨基酸存在极高的相似性，称之为PHR 结构域，主要结合发色团辅基MTHF 和FAD，负责同源二聚化和光信号转导[29-30]。C 端CCE 结构域较为特殊，因物种进化之间的差异，序列存在多样性，但是含有植物典型的DAS（DQXVP-Acidic-STAESS），功能主要表现在隐花色素调控植物生长发育[31]。大多数植物隐花色素CCE 结构域要比动物隐花色素CCE 结构域长，拟南芥CRY-DASH/CRY3 蛋白缺失了CCE 保守结构域。拟南芥CRY1 和CRY2 的CCE 结构域分别大约有180、110 个氨基酸残基[32]。本研究所预测的Hae-P-CRY蛋白CCE 结构域氨基酸残基有140 个，介于拟南芥CRY1 和CRY2 之间。结构域分析表明，在Hae-P-CRY中同样存在上述2 个保守结构域，进一步暗示这个基因编码CRY 蛋白。通过进化树分析发现，Hae-P-CRY蛋白序列与莱茵衣藻、拟南芥一型隐花色素聚为一支，预示着在进化关系上，它们可能存在共同的祖先。

总而言之，上述研究结果为雨生红球藻中Hae-P-CRY 的基因表达研究和确定其功能奠定了基础。同时保守结构域的分析为蓝光信号感知和转导机制提供了依据，并将有助于研究CRY 在蓝光信号通路中相关调控因子的作用机制。例如，雨生红球藻是天然虾青素的理想来源，也是目前制备虾青素的首选藻种。多种研究表明，高蓝光可有效诱导其虾青素的合成与积累，调控主要发生在转录水平上，但具体分子机制并不清楚。雨生红球藻中CRY 基因的表达模式如何？是否具有功能？在蓝光诱导下，体内的CRY 如何感知和转导蓝光信号，并如何与其他已知的蛋白（COP1 和CIBI 等）互作？互作之后通过何种途径激活下游转录因子的表达从而启动雨生红球藻中虾青素合成相关基因的表达，最终合成并积累虾青素，这些问题都有待进行研究。目前，由于有关CRY 的研究主要以高等植物拟南芥为主，CRY 介导的光信号转导路径中的许多疑问没有解决，更多参与CRY 响应蓝光信号的转录因子有待进一步发现。雨生红球藻中CRY 基因的同源克隆和生物信息学分析对于今后更深入系统地研究CRY 蛋白响应蓝光的分子机制有一定的参考价值。

4 结论

本研究获得了雨生红球藻中植物型隐花色素（CRY）的cDNA 全长序列并进行了生物信息学分析。结果表明，Hae-P-CRY 的开放阅读框全长为2 988 bp，编码995 个氨基酸，预测的等电点为6.19，理论分子质量为107.7 ku。与拟南芥来源CRY的相似性达到46.94%，与莱茵衣藻来源CRY 的相似性达到66.6%。CRY 蛋白的典型结构域存在于Hae-P-CRY 中，包括PHR 和CCE。高等植物和真核绿藻来源CRYs 属于共同祖先。首次从雨生红球藻中获得编码CRY 的基因序列，存在与高等植物CRY相似的结构域，暗示其作用机制与高等植物类似，为下一步雨生红球藻中CRY 的表达和功能研究奠定基础，同时为解析蓝光调控雨生红球藻虾青素合成的分子机制提供线索。