两种骨髓间充质干细胞分离方法的对比研究△

杨 雷，朱烁基，刘 健，黄焕雷，郭惠明，陈寄梅，庄 建，赵明一，吴秀山，朱 平

［1.广东省心血管病研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州 510080；2.湖南师范大学心脏发育中心淡水鱼类发育生物学部省共建国家重点实验室，长沙 410081；3.湘雅三医院儿科中南大学，长沙 410013］

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。体内、外实验已经证明，在一定条件诱导下，BMMSCs可跨胚层分化为心肌细胞、神经胶质细胞、肝细胞等多种细胞［1-4］，可以为修复或治疗损伤组织提供细胞来源，是组织工程研究的热点之一［5］。现有的分离小鼠BMMSCs方法包括全骨髓贴壁法、梯度离心法、免疫磁珠法、流式分选法等［6-9］。其中以全骨髓贴壁法应用最广，但此种方法获得的细胞中常混杂有骨髓血细胞（如单核-巨噬细胞等），纯化过程繁琐、漫长。骨组织消化法是近年来开始应用于分离BMMSCs的方法［10］，目前尚未广泛应用于基础研究。本研究旨在比较全骨髓贴壁法和骨组织消化法分离BMMSCs的效果。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物 无特定病原体级雄性昆明白小鼠，3～4周龄，体质量50 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号为：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.2 实验试剂及仪器 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（TransGen公司）；低糖DMEM培养基（LG-DMEM，Sigma公司）；高糖DMEM培养基（HG-DMEM，Sigma公司）；0.25%胰蛋白酶溶液（0.25%Trypsin-EDTA，新赛美公司）；流式抗体：Anti-Mouse/RatCD29-APC、Anti-Mouse CD45-FITC、Anti-Mouse CD11b-FITC、Anti-MouseSca-1-PE-cy7（eBioscience公司）；β-甘油磷酸二钠五水合物、地塞米松、抗坏血酸、茜素红（均购于北京索莱宝科技有限公司）；CO2培养箱（Thermo公司）；流式细胞仪（美国Beckman公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞的分离和培养 全骨髓组：雄性3～4周龄昆明白小鼠，颈椎脱位法处死，置于75%酒精液中浸泡5 min，更换75%酒精液后再浸泡30 s。俯卧位固定小鼠，切开皮肤暴露后背至脚踝的部位，在无菌条件下分离小鼠双侧股骨，剔除股骨周边肌肉、肌腱和结缔组织，取下股骨，剪去股骨两侧骨骺端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器吸取LG-DMEM培养基4 mL，反复冲洗骨髓腔直至骨组织变白。收集骨髓悬液于无菌的青霉素瓶中，将其吹散为单细胞悬液，收集单细胞悬液于15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，用2 mL新鲜的完全培养基（含20%FBS）重悬细胞，调整细胞密度，以1×106个/mL接种于培养皿中，并置于37℃5%二氧化碳培养箱中培养。培养至72 h后进行首次细胞换液，换液前轻轻振荡培养皿5～7次以充分清除非贴壁细胞，此后每3 d换一次液。待贴壁细胞达到80%～90%融合，弃原培养液，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）清洗2次，胰酶消化2 min，进行细胞扩增传代。

骨组织组：收集上述冲去骨髓的股骨于无菌的培养皿中，用无菌纱布摩擦除去股骨表面的结缔组织，用无菌眼科剪小心地将骨组织剪成约1～3 mm3的碎片。用无菌镊将骨碎片转移到15 mL的离心管中，向离心管中加入5 mL含1 mg/mL Ⅱ型胶原酶的新鲜完全培养基（含5% FBS），于37℃摇床中消化2 h，振荡速度为200转/min。消化结束后1 000转/min离心5 min，弃上清液，用PBS清洗两次，然后将骨碎片接种于培养皿中，加入6 mL新鲜的完全培养基（含20% FBS）淹没骨碎片，并置于37℃5%二氧化碳培养箱中培养，培养至72 h后进行首次半量换液，此后每3天换一次液。待贴壁细胞达到80%～90% 融合，弃原培养液，PBS清洗两次，胰酶消化1 min，进行细胞扩增传代。

1.2.2 骨髓间充质干细胞的生长趋势及增殖能力比较 取上述两组第3代BMMSCs，以5×103个/孔接种于24孔板中，每日随机选取2个孔进行细胞消化、计数，并计算平均值，连续计数12 d，绘制成细胞生长曲线。

取上述两组第3代BMMSCs，以2×104个/皿接种，每3天消化、计数、传代一次，以此类推传代五次，计算两组BMMSCs的增殖能力。

1.2.3 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的表面抗原 取上述两组第3代BMMSCs，胰酶消化、离心并重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，以100 μL分装于流式管中，分别加入1 μL CD29-APC、CD45-FITC、CD11b-FITC或Sca-1-PE-cy7单克隆抗体，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤3次，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS重悬细胞，上机检测。

1.2.4 成骨细胞的诱导分化成骨分化 取第4～6代的BMMSCs，胰酶消化、离心并重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，以1×105个/孔接种至24孔板中，每组都设6个复孔，每孔加入600 μL LGDMEM完全培养液（含10%FBS），于37℃5%二氧化碳培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，吸去培养液，加入600 μL成骨分化诱导液HG-DMEM（含5%FBS、10-7 M地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸二钠五水合物及50 μmol/L抗坏血酸）。对照组每孔加600 μL HG-DMEM（含5%FBS）。每3天换液，倒置显微镜下观察细胞的生长及形态变化。培养21 d后进行茜素红染色。

1.3 统计学分析

组间比较采用Students't检验，以（）表示。使用SPSS 16.0软件进行统计分析，选取α=0.05作为检验水平，以P＜0.05时具有统计学差异。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞的细胞形态

分离接种后全骨髓组见大量圆形悬浮细胞，而骨组织组未见悬浮细胞。72 h后可见两组均有大量梭形细胞贴壁，其中全骨髓组细胞散落贴壁，骨组织组细胞呈集落状于骨碎片周围贴壁生长。全骨髓组BMMSCs细胞生长缓慢，培养至第7天可见细胞融合达80%～90%；骨组织组BMMSCs成簇生长，较全骨髓组生长快，培养至第5天可见细胞融合达80%～90%，两组细胞形态一致，均呈长梭形贴壁生长（如图1）。

图1 两种方法分离、培养BMMSCs 至第7 天的细胞形态

两组原代BMMSCs细胞融合达到80%～90%时分别进行传代。全骨髓组BMMSCs细胞传代前用PBS清洗以除去非贴壁细胞。两组BMMSCs传至第3、第6和第9代时细胞形态如图2所示，可见均为长梭形贴壁细胞。两组BMMSCs细胞中的非贴壁圆形细胞均随纯化代数的增加而降低。取第3代以后的BMMSCs进行细胞流式术和成骨分化实验。

图2 两组BMMSCs 培养至第3、第6 和第9 代时细胞的形态比较（×200）

2.2 骨髓间充质干细胞的生长趋势及增殖能力比较

两种方法培养的BMMSCs生长曲线均似S型，在接种后的3 d内为细胞生长的潜伏期，从第4天开始细胞逐渐进入对数生长期，细胞增殖活跃，第10天后生长曲线逐渐步入平台期，步入平台期以后两组各时间节点的细胞数量存在显著性差异（***P＜0.001），骨组织组细胞数量明显多于全骨髓组（见图3A）。

两种方法培养的BMMSCs增殖能力具有显著差异（***P＜0.001）。第1代细胞传代计数结果无明显差异，从第2代开始细胞增殖活跃，增殖速度似指数增长，第5代的骨组织组BMMSCs数量达全骨髓组的4倍（***P＜0.001），骨组织组细胞增殖能力明显大于全骨髓组（见图3B）。

2.3 骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定

分别收集全骨髓组和骨组织组的第3代BMMSCs进行免疫表型鉴定。流式细胞术结果显示，两组细胞均高表达干细胞表面标志物Sca-1及表面黏附分子CD29，其中骨组织组Sca-1及CD29阳性细胞的比例均高于全骨髓组；骨组织组BMMSCs几乎不表达CD45及CD11b，而全骨髓组CD45阳性细胞的比例为3.18%，CD11b阳性细胞的比例为9.11%（图4）。

2.4 骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化

两组细胞的成骨分化诱导鉴定结果显示，在成骨诱导体系诱导21 d后，细胞呈茜素红染色阳性（图5），说明成骨诱导后形成了钙结节。

图3 不同方法获得的BMMSCs 的生长曲线及传代扩增数量比较（注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001）

图4 不同组织获得BMMSCs 的免疫表型鉴定结果

图5 成骨诱导分化结果

3 讨论

BMMSCs由于具有自我更新和多向分化的潜能，已被应用于心肌梗死等疾病的临床治疗［11-12］及大量的组织工程学研究中［5，13］。目前BMMSCs的分离方法主要包括全骨髓贴壁法、梯度离心法、免疫磁珠法、流式分选法等，其中应用最广的是全骨髓贴壁法。由于骨髓腔中绝大部分是造血细胞，间充质细胞的含量极少，仅占0.001%～0.01%［13］。因此，全骨髓贴壁法获取的BMMSCs量少且含有大量的造血细胞，不仅使得随后的纯化效率低，也会影响BMMSCs的生长，从而无法短时间内获得大量BMMSCs。梯度离心法［7］是根据细胞形态和质量差异通过梯度淋巴分离液分层获得，由于骨髓中细胞种类繁多，部分细胞形态质量相近，BMMSCs容易进入邻近分层细胞里，导致丢失。免疫磁珠法及流式分选法是基于抗原抗体特异性结合的原理，所获取的BMMSCs纯度较高，但分离过程中可能会影响BMMSCs活性，同时也需要较高的成本和大量的样本。

研究表明BMMSCs主要存在于骨内膜及骨密质中［13］，单纯的骨髓腔冲洗不能把这部分细胞有效地分离出来。骨组织消化法在骨髓腔冲洗干净后将骨组织剪成碎片，用Ⅱ型胶原酶消化后置于培养基中培养，期间，大量BMMSCs逐渐从骨组织迁出并进入培养基中贴壁生长。这种方法既能充分分离骨组织中的BMMSCs，又能减少造血细胞的污染，在短时间内纯化获得大量BMMSCs。

本研究中骨组织消化法接种72 h后可见较多细胞在骨片周围贴壁生长，未见大圆细胞漂浮，并且贴壁细胞融合达到80%～90%所需时间明显缩短，结合免疫表型鉴定和诱导分化的结果，我们认为骨组织消化法获得的BMMSCs纯度高，能在短时间内获得大量细胞。然而，有研究认为II型胶原酶消化影响细胞活性及增殖能力，本实验尚未涉及这方面研究，需要进一步验证及完善骨组织消化法的实验条件及方法。

综上所述，骨组织消化法操作简单、成本低，且获得的BMMSCs纯度高，可短时间内纯化得到大量细胞，是基础研究中值得推广的实验方法。