植物激素对草地早熟禾愈伤组织的诱导

张学通 张博学 林媛媛

摘 要：选取3种草地早熟禾（Poa pratensis L.）为试验材料，以成熟并且饱满的种子为外植体，在MS基础培养基上添加不同种类和浓度植物激素，筛选适宜草地早熟禾愈伤组织的诱导方法，为建立其高效的再生体系奠定基础。结果表明，“如意”最佳的初代和继代愈伤培养基为MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA;“蓝之梦”最佳的初代和继代愈伤培养基为MS加3.0mg/L2，4-D;“优美”最佳的初代愈伤培养基为MS加3.0mg/L2，4-D，其最佳的继代培养基为MS加2.0mg/L2，4-D。

关键词：草地早熟禾;愈伤组织;组织培养;植物激素

中图分类号：S-3       文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200430001

草地早熟禾（Poa pratensis L.）为禾本科早熟禾属，是一种优质的冷季型草坪草，其优点包括耐冷、绿期较长、根系发达、叶色浓绿、抗性较好，在城市园林绿化、改善环境等方面被广泛利用[1，2]。研究发现，草地早熟禾属于多倍体植物，并且为无融合生殖方式，构建成熟的再生体系是基因育种的重要手段之一[3]。植物生长调节剂对于不同植物的愈伤组织诱导有较大差异，不同激素种类及激素浓度配比直接影响其再生体系的构建。本研究选择3种抗旱性较强的草地早熟禾品种，研究不同激素种类和浓度对于其愈伤组织诱导情况的差异，筛选适宜的初愈培养基及继代培养基，为后续完整再生体系的构建提供数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取的供试材料为3个草地早熟禾品种，分别是“如意”、“蓝之梦”、“优美”，均购于北京正道生态科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒

本研究选择成熟并且饱满供试草地早熟禾种子，用自来水冲洗种子1h，用无菌水冲洗3次，浸泡于无菌水30min。在无菌环境中进行消毒，消毒方式分为4种：75%乙醇消毒30s，再用1%NaClO消毒5min，无菌水冲洗5～6遍，之后将种子置于无菌滤纸;75%乙醇消毒30s，再用1%NaClO消毒10min，无菌水冲洗5～6遍，之后将种子置于無菌滤纸;75%乙醇消毒60s，再用1%NaClO消毒5min，无菌水冲洗5～6遍，之后将种子置于无菌滤纸;75%乙醇消毒60s，再用1%NaClO消毒10min，无菌水冲洗5～6遍，之后将种子置于无菌滤纸。统计7d的污染率，21d的褐化率。

1.2.2 草地早熟禾种子愈伤组织的诱导

将消毒后的种子接种于基本MS培养基，培养基琼脂浓度为10g/L，蔗糖浓度为30g/L，不同激素组合方式见表1。每个培养瓶接种10～20粒种子，每个处理接种20瓶。将培养瓶置于25℃黑暗培养，每7d记录各处理的出愈率及生长状态，28d之后统计愈伤组织的诱导率。将生长良好的愈伤组织接种到新配置的继代培养基中，42d之后观察并统计愈伤组织继代培养的情况。

1.2.3 数据分析

利用统计分析软件SPSS22.0对诱导率相关数据进行分析;采用Graphpad prism 8.0进行图形的制作。

2 结果与分析

2.1 消毒方式对外植体染菌率和褐化率的影响

由图1可知，乙醇、NaClO溶液消毒时间对草地早熟禾种子的污染率和褐化率均有影响。消毒方式4（75%乙醇60s加1%NaClO 10min）的污染率最低，其次是消毒方式2（75%乙醇30s加1% NaClO 10min）（见图1-A）。综合4种消毒方式的污染率，发现随着NaClO消毒时间的减少，污染率明显提升。4种消毒方式对愈伤组织褐化率的影响排序为1<2<3<4，结果发现消毒时间越长，褐化率越高。

2.2 不同激素对草地早熟禾初代愈伤组织诱导的影响

由图2可以看出，草地早熟禾因品种不同，其2，4-D与6-BA激素组合诱导的出愈率也存在一定差异。在N-5（MS加1.0mg/L 2，4-D加0.1mg/L6-BA）培养基中，草地早熟禾“如意”的出愈率最高，其次是N-3（MS加3.0mg/L2，4-D）的诱导培养率较高。这与“蓝之梦”的诱导结果差异较大，“蓝之梦”在N-2（MS加2.0mg/L2，4-D）和N-3培养基中出愈率最高，而其它组培养的出愈率较低。草地早熟禾“优美”仅在N-3培养基中出愈率最高，其它组出愈率较低。综合N1、N2、N3、N4的数据，研究发现3种草地早熟禾种子的出愈率均随着2，4-D浓度的增加逐渐增多，但2，4-D增加为4mg/L时，出愈率被显著抑制。综合N5、N6、N7、N8的数据，仅“如意”在N5培养基诱导下出愈率较高，“蓝之梦”、“优美”的4种培养基的出愈率均较低。对比N1～N8的数据可以发现，2.0～3.0mg/L2，4-D诱导的出愈率较高，而2，4-D与6-BA混合培养基大部分抑制了愈伤组织的出愈率。

2.3 不同激素对草地早熟禾继代愈伤组织诱导的影响

将初代培养基诱导得到的愈伤组织，接种到对应的继代培养基中（见表2）。结果发现，“如意”在2种不同的继代培养基中，增值倍数均超过2.32，其中MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA的增值得到的愈伤组织的质量更好，呈淡黄色，多数愈伤呈颗粒感。“蓝之梦”在MS加3.0mg/L2，4-D的培养中增值状况最好，增值率高，且愈伤质量良好。“优美”在MS加2.0mg/L2，4-D继代培养中不仅增值倍数较高，而且生长状态良好，呈现淡黄色的颗粒感。综上结果，“如意”最佳的继代培养基为MS加1.0mg/L2，4-D加0.1mg/L6-BA，“蓝之梦”的最佳继代培养基为MS加3.0mg/L2，4-D，“优美”的最佳继代培养基为MS加2.0mg/L2，4-D。