IMD1-53通过miR-34a延缓泡沫细胞脂质聚集

孙卓成，马生贤，田 荣，张 玲，李思睿，杨晓玲

中介素(IMD)是2004年新发现的血管活性多肽，属于降钙素基因相关肽超家族成员(CGRP)[1]，其前体蛋白在体内可以酶解为IMD1-47、IMD8-47和IMD1-53等三个活性片段[2]。研究显示，IMD1-53除了具有舒张血管[3]、降低血压[4]等作用外，还能抑制泡沫细胞的形成[5]。miRNAs是20～25 nt的具有调控功能的非编码RNA，在体内参与了多个生物学过程，而miR-34a参与了动脉粥样硬化的发生发展[6]。但是IMD1-53是否通过miR-34a抑制泡沫细胞的形成尚不清楚。本研究以泡沫细胞为研究对象，探讨miR-34a在IMD1-53抑制泡沫细胞脂质沉积中的作用，为临床脂代谢紊乱相关疾病的研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：IMD1-53购自凤凰制药公司，RPMI-1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司，DNA 提取试剂盒购自碧云天生物科技公司、RNA 提取试剂盒购自天根生物有限公司，荧光定量PCR 试剂盒购自TaKaRa公司，DNA修饰试剂盒购自美国Zymo公司，TC和TG检测试剂盒购自南京建成公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 细胞培养：参考文献方法培养THP-1细胞[7]，先用佛波酯(终浓度为100 nM)刺激24 h 使之分化为巨噬细胞，再用氧化低密度脂蛋白(终浓度50 mg/L)刺激24 h 使之变成泡沫细胞。将诱导成功的泡沫细胞随机分为对照组、IMD1-53干预组(终浓度为1 μM)，继续培养24 h，用于后续实验。

1.3 荧光定量PCR检测泡沫细胞miR-34的mRNA水平：用Trizol试剂按操作说明方法提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的A260和A280。按照miRNA逆转录试剂盒说明书制备cDNA，首先向miRNA加Poly尾进行修饰，然后合成miRNA cDNA第一链。合成的cDNA用于下游PCR扩增条件：95 ℃ 5 min启动，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s进行40个循环。表达量用内参U6进行校正，结果用2-△△CT法分析。

1.4 甲基化特异性PCR检测miR-34a启动子甲基化：按照试剂盒说明书提取细胞DNA，并对基因组DNA进行甲基化处理。由于DNA甲基化常发生于基因启动子区CpG岛中的胞嘧啶，因此，在UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)网站中寻找miR-34a基因启动子区序列，使用甲基化引物设计软件(htty://www.urogene.org/methprimer)设计miR-34a的引物，包括甲基化引物和未甲基化引物。序列如下：甲基化引物，上游：5’- GGGATTAGGTTTTGAACGC-3’，下游：5’-CCTAAAAACAAAAAACGCGT-3’；未甲基化引物，上游：5’-AAAGGGATTAGGTTTTGAATGT-3’，下游：5’-TCCTAAAAACAAAAAACACATAC-3’。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。

1.5 细胞内胆固醇含量测定：用刮刀刮取培养的细胞，制成细胞悬液，PBS洗涤3次，超声裂解1 min，考马斯亮蓝G-250对样品中的蛋白进行定量，1 000 r/min离心10 min，弃去上清液；收集细胞沉淀，超声破碎细胞后在96孔板空白孔、校准孔、样本孔中分别加入蒸馏水、校准品、样本与工作液，酶标仪测定吸光度值，再用对应公式计算细胞内胆固醇含量(TC)和甘油三酯含量(TG)。

2 结果

2.1 IMD1-53抑制泡沫细胞脂质聚集：泡沫细胞经IMD1-53处理后，泡沫细胞内TC和TG的含量分别降低36.4%和37.8%，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 IMD1-53对泡沫细胞内TC和TG的影响

2.2 IMD1-53对泡沫细胞miR-34a mRNA和甲基化的影响：与正常对照组相比，IMD1-53组泡沫细胞内miR-34a的表达减少了62.2%，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步用甲基化PCR检测泡沫细胞启动子区的甲基化水平，结果显示与正常对照组相比，IMD1-53处理泡沫细胞后，miR-34a启动子区甲基化水平升高了1.05倍，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 IMD1-53对泡沫细胞miR-34a mRNA和甲基化的影响

3 讨论

动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞绝大部分来自于血液单核细胞，当发生炎症时，单核细胞向炎症部位浸润并伸出伪足变成巨噬细胞，进一步吞噬ox-LDL以及过量的胆固醇生成脂滴，最终触发泡沫细胞的形成[8]。因此，减少泡沫细胞内脂质沉积能够延缓动脉粥样硬化的发生发展。

IMD又称为肾上腺髓质素2，是降钙素相关基因肽超家族的新成员，具有扩张血管、降低血压、稳定血管内皮屏障等作用，是一种强的内源性的心血管保护因子，具有潜在的临床应用前景[3-4]。本研究结果显示，泡沫细胞用IMD1-53干预后，细胞内胆固醇和甘油三酯水平明显降低，表明IMD1-53能够抑制泡沫细胞内的脂质沉积，与文献报道一致[5]。但IMD1-53是通过哪些机制影响泡沫内脂质沉积尚不清楚。

miRNAs是一类由内源性基因编码的小分子非编码RNA，可通过诱导mRNA的降解、翻译抑制或其它形式抑制靶基因的表达，在调控生物体的生长、发育及分化等方面发挥重要作用。研究显示，miR-34a在乳腺癌中主要作用为抑制癌细胞生长、增殖及迁移[9]，其还可与c-myc结合，降低c-myc的蛋白表达水平，从而抑制肺癌[10-11]。另外，miR-34a可通过调控靶基因Notch1参与乳腺癌细胞凋亡[12]。由此可见，miR-34a在许多疾病中发挥重要作用。另有研究报道，抑制miR-34a的表达，可减少心肌细胞凋亡[13-14]，因此，miR-34a可能是心血管疾病治疗的重要靶点。本研究结果显示，用IMD1-53处理泡沫细胞后，miR-34a表达降低，提示IMD1-53抑制泡沫细胞内的脂质沉积与下调miR-34a的表达有关。DNA甲基化是表观遗传学的重要内容，能够逆向调控基因的表达[15]，常常发生于基因启动子区的CpG岛[16]。我们用生物信息学分析了miR-34a启动子区的甲基化情况，发现在其启动子上游约350～580 bp附近有一个CpG岛，提示miR-34a的表达可能受到甲基化调控。进一步用甲基化特异性PCR检测miR-34a启动子甲基化水平，发现IMD1-53干预泡沫细胞后，miR-34a启动子区甲基化水平明显增加，提示miR-34a启动子高甲基化可能是IMD1-53延缓脂质沉积的重要机制。

综上所述，IMD1-53可抑制THP-1单核源性泡沫细胞miR-34a的表达，延缓泡沫细胞的形成，miR-34a启动子区甲基化在IMD1-53延缓泡沫细胞脂质形成中具有重要作用，但IMD1-53是如何影响miR-34a启动子区甲基化的机制，还需要进一步探究。