血小板反应蛋白1在局灶节段性肾小球硬化伴急性肾小管间质损伤的表达

袁 蓓 夏园园 吕亚男 张明超 赵 越 陈朝红 曾彩虹

局灶节段性肾小球硬化(FSGS)属于足细胞病,临床主要表现为肾病综合征，许多患者初始对激素治疗敏感，复发后激素再治疗常不敏感，或者初始就对激素治疗不敏感，最终进展为终末期肾病(ESRD)[1-3]。FSGS的损伤不仅在足细胞，常伴不同程度肾小管间质的急性损伤[4]。东部战区总医院国家肾脏疾病临床医学研究中心前期研究显示FSGS患者急性肾损伤(AKI)的发生率达44.4%[2]，而组织学不同程度的急性肾小管间质损伤达88%[1]。因此FSGS急性肾小管间质损伤是不容忽视的问题，而且影响患者对激素治疗的敏感性[5]。虽然FSGS肾小管间质损伤机制已有大量相关研究，但其发生机制尚不清楚。血小板反应蛋白1(TSP-1)是一种细胞外基质聚糖蛋白，与不同配体或受体结合，在细胞的黏附、迁移、增殖、损伤修复、炎症、血管形成过程中发挥重要作用[6]。在肾脏缺血再灌注损伤(IRI)所造成的AKI动物模型中发现肾小管TSP-1表达迅速增加[7]。因此本研究旨在探讨FSGS伴急性肾小管间质损伤时，肾组织TSP-1及其受体信号调节蛋白α(SIRPα)的表达情况，并分析TSP-1表达与临床病理的相关性。

对象和方法

研究对象纳入2015年3月至2017年3月在国家肾脏疾病临床医学研究中心住院经肾活检确诊的FSGS，同时伴急性肾小管间质损伤的患者。入选标准：(1)尿蛋白定量>3.5 g/24h，血白蛋白<30 g/L；(2)特发性FSGS伴有急性肾小管间质损伤。排除标准如下:(1)合并药物或感染相关小管间质性肾炎；(2)继发性FSGS,如高血压肾损害、肥胖相关肾损害、有机溶剂肾损害等；(3)中毒、创伤、感染、手术相关急性肾脏损伤；(4)其他:ESRD、常染色体显性遗传性多囊肾、肾移植、肿瘤、肝硬化、活动性感染等。并收集15例肾癌切除术患者的癌旁正常肾组织作为正常对照。

临床资料收集患者病程、性别、年龄等一般资料，肾活检时实验室检查指标，包括24h尿蛋白定量、血清白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、血清肌酐(SCr)，尿视黄醇结合蛋白(RBP)和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)等。

肾脏病理所有病例均在B超引导下行经皮肾穿刺活检术，常规行光镜、免疫荧光及电镜染色。急性肾小管间质损伤的病理定义：肾组织皮质区非萎缩区域的肾小管急性损伤(近端小管上皮细胞细胞刷状缘脱落、甚至坏死)，间质明显的炎细胞浸润，伴或不伴小管炎和(或)间质水肿。急性肾小管间质损伤程度根据肾小管间质病变累及范围分级：<25%为轻度；25%～50%为中度；>50%为重度。

免疫组化检测取肾组织石蜡切片，脱蜡入水，利用高压锅进行抗原修复，分别加入一抗TSP-1抗体(Santa Cruz)、SIRPα抗体(Abcam)，室温孵育2h，PBS洗5 min，加入二抗室温孵育30 min，PBS洗5 min，DAB显色，苏木素复染2 min，中性树胶封片。利用徕卡Aperio数字病理系统(ScanScope AT Turbo)进行全切片扫描，手工圈出蛋白染色阳性区域和肾小管间质总区域，通过Aperio相关配套软件计算出相应面积，并计算蛋白分子表达阳性率=(蛋白分子阳性表达面积/肾小管间质总面积)×100%。

统计学方法采用《SPSS19.0》软件进行统计分析。以单样本Kolmogorov-Smirnov检验对数据进行正态检验。所有计量资料，以均数±标准差或中位数(四分位间距)表示，组间比较应用方差分析或Kruskal-Wallis H检验；计数资料的组间比较采用卡方检验。正态分布数据采用Pearson相关系数，非正态分布数据采用Spearman相关系数评价变量间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

患者一般情况56例FSGS伴急性肾小管间质损伤患者的临床资料见表1，其中以男性居多(占71.4%)。根据急性肾小管间质损伤程度分组，轻度组22例(39.29%)，中度组18例(32.14%)，重度组16例(28.57%)。重度组与轻中度组患者相比，病程更长,尿NAG、SCr明显升高(P<0.05)。三组间蛋白尿并无差别。

肾组织TSP-1及SIRPα的表达正常肾组织中TSP-1免疫组化染色阴性(图1A)，FSGS伴急性肾小管间质损伤患者TSP-1阳性表达主要集中于近端肾小管上皮细胞(图1B)。切片扫描后，经过计算得出TSP-1表达阳性率见表2，急性肾小管间质损伤轻度组为14.41%±6.18%，中度组为10.03%±6.61%，重度组为13.78%±8.48%，不同组间TSP-1表达阳性率无明显差异。正常肾脏组织中，SIRPα在肾小管间质及肾小球均有表达(图1C)，其表达阳性率与FSGS伴不同程度急性肾小管间质损伤患者比较无明显差异(表2)。

表1 局灶节段性肾小球硬化伴不同程度急性肾小管间质损伤患者的临床资料比较

NAG:N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP:视黄醇结合蛋白；AKI：急性肾损伤；△：轻度组vs中度组，P<0.05；#：中度组vs重度组，P<0.05；*：轻度组vs重度组，P<0.05

图1 免疫组化染色TSP-1与SIRPα在正常(A、C，×200)及FSGS伴急性肾小管间质损伤(B、D，×200)肾组织中的表达TSP-1：血小板反应蛋白1；SIRPα:信号调节蛋白α;FSGS:局灶节段性肾小球硬化

TSP-1表达与临床指标的相关性TSP-1表达阳性率与临床指标进行双变量相关性分析结果见表3。TSP-1表达阳性率与病程、尿RBP、尿蛋白定量、SCr呈负相关(P<0.05)。TSP-1表达阳性率与年龄、尿NAG、Alb、血脂无相关性。

将FSGS伴急性肾小管间质损伤的患者根据TSP-1表达阳性率分为两组，<10%分为TSP-1低表达组20例(35.71%)；≥10%为TSP-1高表达组36例(64.29%)。两组患者临床及实验室指标的比较见表4。TSP-1低表达组的病程、尿蛋白定量、SCr和尿RBP均明显高于高表达组。其他指标两组间无显著差异。

表2 TSP-1与SIRPα肾小管表达阳性率比较

TSP-1：血小板反应蛋白1；SIRPα:信号调节蛋白α；#：与正常对照组比较，P<0.01

表3 TSP-1阳性率与临床指标的相关性分析

TSP-1：血小板反应蛋白1；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP：视黄醇结合蛋白

表4 TSP-1表达低组与高组临床指标比较

TSP-1：血小板反应蛋白1；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；RBP：视黄醇结合蛋白

讨 论

FSGS作为肾病综合征的常见病因之一，占原发性肾小球疾病的比例近年呈上升趋势，本中心发现，2003年至2014年对比1979年至2002年从6.00%上升到7.34%[8]。FSGS的病理类型具有多样性，其临床表现及对治疗的反应不一，成为导致ESRD的常见原发性肾小球疾病之一[9]。FSGS作为足细胞损伤的疾病， 临床上常伴AKI[2]，病理上常伴不同程度急性肾小管间质损伤[1]。本研究选择病理上均伴急性肾小管间质损伤的FSGS病例，以轻度损伤组最多见(39.29%)，其次为中度组(32.14%)，重度组最少(28.57%)。与轻、中度损伤患者相比，重度损伤患者AKI病程较长,尿NAG、SCr较高，病情更严重。而轻度和中度组临床表现无明显差别，提示病理损伤严重程度有时和临床肾功能损伤并不平行，也提示肾活检的重要性，有利于判断肾小管间质病理损伤的程度，从而指导治疗。研究初始，考虑设置FSGS不伴急性肾小管间质损伤一组作为对照，由于本研究选择的是尿蛋白>3.5 g/d FSGS的病例，实际观察中发现这些患者在病理上均伴有不同程度肾小管间质急性损伤，很难确定FSGS不伴急性肾小管间质损伤，且病例数少，因此最终未设置这一组。在嘌呤霉素诱导的微小病变和FSGS模型中，也常伴小管间质的急性损伤，因此未设置病理不伴肾小管间质急性损伤的对照组。

已有研究表明肾病综合征的肾小管间质损伤可能是由蛋白尿直接和间接毒性、细胞因子与生长因子造成的细胞外基质(ECM)合成分解平衡紊乱等多种原因所介导[10-11]。FSGS患者出现急性肾小管间质损伤可能与以上因素相关，也可能有其他机制参与。急性损伤时肾小管表达的分子在其中也可能起到一定作用。

TSP-1作为一种细胞外基质聚糖蛋白，可与不同配体或受体结合，在细胞增殖、损伤修复、炎症、血管形成过程中发挥重要作用[6]。动物研究表明，肾脏缺血再灌注所造成的AKI模型，肾小管TSP-1表达迅速增加[7]。本研究主要观察FSGS伴急性肾小管间质损伤患者肾组织中TSP-1及其受体SIRPα的表达情况，发现FSGS伴急性肾小管间质损伤时，近端肾小管上皮细胞中TSP-1表达增加，但在不同程度的急性肾小管间质损伤中TSP-1表达阳性率无显著差异。提示肾小管间质损伤程度和TSP-1表达阳性率之间似乎不存在明显相关性，TSP-1的表达量不适用于衡量急性肾小管间质的损伤程度。既往体外共培养研究提示，TSP-1可通过细胞间交互作用影响其他细胞。如成纤维样基质细胞分泌的TSP-1通过作用于胃癌细胞上的Intervenolin，抑制胃癌细胞的增长[12]；基质中的TSP-1与内皮细胞的CD47相结合会影响NO合成，导致内皮细胞功能障碍[13]。所以，在FSGS伴急性肾小管间质损伤过程中，TSP-1作为一种细胞外基质，由肾小管上皮细胞产生后，可能不仅作用于肾小管上皮细胞，还可能通过与配体的结合，作用于管周毛细血管内皮细胞等其他细胞，并介导内皮细胞功能障碍，随着时间的偏移，最终可能导致管周毛细血管的减少，影响间质纤维化。但是在人体内标本中探讨肾小管分泌的TSP-1对其他细胞的作用存在一定难度，需要进一步体外和动物实验来研究证实。

我们进一步观察TSP-1的受体SIRPα在FSGS伴急性肾小管间质损伤中的表达。正常肾脏组织中SIRPα的表达量与FSGS伴不同程度急性肾小管间质损伤相比较，无明显差异，提示FSGS患者发生急性肾小管间质损伤时，未能观察到SIRPα表达量的变化，TSP-1是否可能通过其他受体或者配体介导了这一病理生理过程，需要进一步研究。

本研究发现TSP-1表达阳性率与病程、尿RBP、尿蛋白定量、SCr成负相关。并且按照TSP-1表达阳性率将患者分为TSP-1表达低组和TSP-1表达高组，发现TSP-1表达低组病程较长，尿蛋白定量、血肌酐、尿RBP均显著高于TSP-1表达高组。提示在病程初期，也就是损伤的早期，SCr尚处于低水平时，肾脏组织TSP-1表达升高，随着病程时间延长，TSP-1表达下降。这与动物实验中，利用肾脏缺血再灌注损伤模拟AKI时，TSP-1在缺血再灌注3h即有表达升高，但在24h却表达下降[7]，并且在24h，TSP-1的表达量与SCr成负相关的结果相吻合[14]。推测TSP-1表达量的上升可作为反映早期急性肾小管间质损伤新的组织学指标。

本研究是回顾性研究，未检测FSGS伴急性肾小管间质损伤患者血液及尿液中TSP-1表达量变化。因为在血液中，TSP-1主要由血小板的α颗粒贮存及分泌，当凝血过程启动，血小板则被激活，会释放其α颗粒内贮存的TSP-1。且有研究表明血清作为凝血过程启动的产物，其TSP-1浓度显著高于血浆，约为血浆的100倍，反映的是血小板释放的TSP-1的量，并不能作为有意义的循环中TSP-1的浓度[15]。故尚不能利用外周血和尿中TSP-1浓度的变化，作为发生急性肾小管间质损伤的早期指标。

小结：本研究初次探讨了在FSGS伴急性肾小管间质损伤患者肾组织中TSP-1的表达变化及意义。FSGS伴急性肾小管间质损伤时肾小管TSP-1表达升高，表达阳性率的高低与肾功能损伤程度相关。