霍山石斛多酚氧化酶活力测定条件的优化

张珍林，孙 立，王梦荷，刘 帅

(1.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012；2.植物细胞工程安徽省工程技术研究中心，安徽 六安 237012；3.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

霍山石斛(学名：DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗称米斛，是中国特有、兰科石斛属的草本植物，为国家一级保护植物，中国国家地理标志产品[1](P117)。主要产于安徽省霍山县，属大别山区，大多成长于云雾缭绕的绝壁上，崖石缝隙间和高大树木之上，山地林中树干上或者山谷中岩石上[2]。

据《中华人民共和国药典》记载[3](P70)，霍山石斛鲜品能大幅度地提高人体内超氧化物歧化酶(SOD)水平，有效地延缓衰老，对过度熬夜、经常用脑、吸烟饮酒太过，身虚力乏者，频繁食用十分相宜。而且霍山石斛鲜品对眼睛有明目作用，甚至能起到调和阴阳、壮阳补肾以及美容养颜之功效。所以近年来，模拟霍山石斛自然生长环境的大棚种植在不断增加，产量得到了大幅度增高，但贮藏保鲜及商品化处理技术仍跟不上鲜品上长的量，霍山石斛采后鲜品的状况仍未有很好的改善，多数只能采用干制技术来提高保存期[4-5]，这也使得霍山石斛产品价格偏高。因此，研究霍山石斛鲜品的保鲜手法和工艺，延长其有效保鲜期，对促进霍山石斛鲜品产业发展具有深远确切的意义。

大量研究认为，植物鲜品不易保藏，这和病理、生理因素分不开[6-8]，也和鲜品不同采收期分不开[9-10]。研究霍山石斛在不同生长阶段体内活性物质的变化，这和过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)主要体系酶关系极为密切，酶是霍山石斛鲜品抗氧化作用功效体现的物质基础，但也是易导致植物体采后褐变，品质变差的物质基础，所以，钝化酶的活性在生产上常见，主要用超高压热烫、高温热烫、低温冷藏以及气调保鲜等技术手段，以其达到灭酶保鲜[11]。

本实验旨在研究提取不同生长期采收的霍山石斛主要酶以及测定酶活，为深入了解霍山石斛生长过程中主要酶活性动态变化情况，以及实体加工业提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

霍山石斛一年生鲜条、三年生鲜条，由皖西学院安徽省中药资源保护与持续利用工程中心提供。

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、聚乙烯吡络烷酮(PVP)、邻苯二酚、30%饱和度硫酸铵等均为分析纯，购于国药化学集团试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-52AA型旋转蒸发器、高速组织捣碎机(上海净信实验设备科技部)、SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵、ZMD-2型电子分析天平、DHG-9101-1型电热恒温鼓风干燥箱、HH-4C型数显恒温水浴锅、研钵、TU1901型紫外分光光度计、PHS-25型PH计、LDZX-50KBS型高压蒸汽灭菌锅、SW-CJ-IBU型超净工作台、MIKRO120型小型台式高速离心机。

1.3 试验方法

1.3.1 粗酶液的提取

准确称取霍山石斛鲜条一年生、三年生各5.00 g，加入0.5 g不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质)和100 ml 0.1 mol/L磷酸缓冲液，混合并磨成匀浆，使用循环水式多用真空泵过滤，滤液中加入30%饱和度硫酸铵，用低温离心机中5000 r/min离心10 min，分两次离心，除沉淀，于上清液中再加入硫酸铵使其达到60%饱和度，再次离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3 ml 0.01 mol/L磷酸缓冲液中，即得粗制酶液。

1.3.2 酶活性的测定

根据查阅文献[12]，确定采用邻苯二酚法测量霍山石斛多酚氧化酶活力。

在试管中加入3.9 ml 0.05 mol/L磷酸缓冲液，1.0 ml 0.1 mol/L儿茶酚在37 ℃恒温水浴中保温10 min，之后加入不同体积酶液进行酶活性测定(可视酶活性增减用量)，迅速摇匀，倒入比色皿内，将其于525 nm波长处，以时间扫描方式，在1～2 min时间内测定吸光度变化(A)值。

1.3.3 酶活力测定条件的优化

根据本实验初步研究目的，在测定酶活力过程中，对缓冲溶液的pH值、酶浓度、反应温度、生长年限等单因素进行分析，考察单因素最佳范围，再利用正交试验优化单因素，从而获得多酚氧化酶酶活力最佳测定条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 缓冲溶液pH值

影响多酚氧化酶活力的因素缓冲液的pH值如图1所示。由图1得知当缓冲溶液的pH从6.0增加到6.5时，酶活力显著增大。而继续增加pH值之后，酶活力反而减小。在pH为6.5的时候，酶活力最大。所以pH为6.5是最佳水平。

图1 缓冲液的pH值对多酚氧化酶活力的影响

分析实验中所使用的缓冲溶液pH值对多酚氧化酶活力的影响，可以了解霍山石斛多酚氧化酶适合在中性或偏酸性的条件下存活，pH值过低不适合酶活性激发，过高也会抑制酶活性，过低过高都不能使酶活性达到最优，所以根据单因素确定缓冲溶液pH值为6.5时是最优酶活力测定值。

2.1.2 反应温度

影响多酚氧化酶活力的因素反应温度如图2所示。看图2得，当反应温度从0 ℃上升到40 ℃时，酶活力显著增大。但是在继续升温之后，酶活力反而会变小。在反应温度为40 ℃的时候，酶活力最大。所以反应温度40 ℃是最佳水平。

图2 反应温度对多酚氧化酶活力的影响

分析实验过程中反应温度对多酚氧化酶活力的影响，可以确定温度的影响也是有最佳条件的，超过或不到最佳条件酶活性不能充分展现，只有在合适的温度下才能达到最佳酶活力，本实验条件下反应温度为40 ℃是最佳。

2.1.3 酶浓度

影响多酚氧化酶活力的因素酶浓度如图3所示。图3显示，在反应过程中，随着加入的酶浓度逐渐增大，整个反应体系中酶活力增强。但当酶浓度达到1.0 ml时，再继续增加酶浓度，酶活力增加趋于平缓直到不再变化，由此得出当酶浓度为1.0 ml时，酶活力达到最大。

图3 酶浓度对多酚氧化酶活力的影响

分析酶浓度对多酚氧化酶活力的影响，图3显示在一定范围内，酶浓度对酶活力的影响成正比，随着酶用量的不断增加，酶活力也逐渐增大。但是当酶溶液达到一定用量时，酶活力增加趋势平缓，继续增加酶浓度酶活力也不会再出现大幅度变化。由此确定霍山石斛多酚氧化酶的酶浓度为1.0 ml时最优。

2.1.4 生长年限

霍山石斛生长年限对多酚氧化酶活力的影响如表1所示。由表1看出，从测定两个生长年限的数据，生长年限为1年生的霍山石斛酶活力为28 U，生长年限为3年生的霍山石斛酶活力为72 U，3年生数据要明显大于1年生的数据。

表1 生长年限对多酚氧化酶活力的影响

分析表1，可大致判断，随着霍山石斛生长年限的增加，多酚氧化酶活性是逐渐增加的，也即是多酚氧化酶酶活力呈现上涨趋势，且明显，所以后续在进行正交优化酶活力测定条件时仅以3年生霍山石斛为检测对象。不在作为正交优化考虑因素。

2.2 正交实验结果与分析

2.2.1 正交分析因素与水平

正交分析因素与水平见表2。

表2 正交分析因素与水平

2.2.2 正交结果与分析

根据得到的正交实验统计表结果，见表3。

由表3可知，缓冲液的pH值、多酚氧化酶浓度和反应温度这三个因素的极差大小顺序为A>C>B，即霍山石斛多酚氧化酶活力测定三主要影响因素的作用大小顺序为：缓冲液的pH值>多酚氧化酶浓度>反应温度。霍山石斛多酚氧化酶活力测定的最佳条件为A3B1C2，即缓冲液的pH值为6.5，反应温度为40 ℃，酶浓度为1.0 ml，生长年限为3年，所测得最高酶活力值为39.153 U。

表3 正交分析结果

3 讨论与结论

石斛的生长需要适宜的自然条件，安徽六安霍山得天独厚的地理环境和气候优势起到非常重要的作用。植物组织中PPO都具有各自明显紫外吸收特征，不同植物不同组织中PPO的紫外吸收峰也不相同，如康娟等在丝瓜多酚氧化酶及过氧化物酶酶学特性的研究中，指出丝瓜PPO的最大吸收波峰为408 nm[13]；赵东海等对蘑菇中多酚氧化酶的酶学特性研究中，指出蘑菇PPO的最大吸收峰为410 nm[14]。在本实验中，对霍山石斛PPO的最大吸收峰为525 nm，当以邻苯二酚为底物，浓度为0.1 mol/L，多酚氧化酶浓度为1.0 ml，缓冲液的pH值为6.5、反应温度为40 ℃且生长年限为三年期时活性最高。

PPO作为各种植物的必要成分而存在，对它进行深入研究是很有必要，如柳素洁对香蕉多酚氧化酶性质及在果酒发酵中褐变控制的研究，明确了PPO是引起香蕉酶促褐变的主要因素并采取合适方法来抑制[15]；李全文对桑叶多酚氧化酶的提取、纯化及其固定化研究，明确了桑叶PPO的制备[16]。霍山石斛是目前研究药用性质极佳的一种多年生草本中药，具有优良的营养和保健价值，但由于种植条件要求高，加工中也存在很多困难，霍山石斛多为枫斗保健饮用，被加工制成其他产品形式的不多，尤其在食品工业上。霍山石斛加工中也存在酶促褐变，极易使产品品质劣变，影响产品市场，深入研究霍山石斛酶促褐变的因素及控制技术对阐明石斛褐变规律，促进霍山石斛加工技术的发展，提高产品的品质具有理论和实际意义，本实验探讨了霍山石斛中PPO的酶学特性，为后期霍山石斛PPO的分离、提取、纯化和霍山石斛新产品的开发奠定了基础。