玉米锌指蛋白基因ZmLSD1 的生物信息学及表达特性分析

周开明，赵白杨，张丙林，刘卫娟，邹华文

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

非生物胁迫是威胁植物生长发育的主要环境因素之一，例如干旱、高温、高盐等逆境。 转录因子作为具有调节基因表达功能的调控因子，在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。 锌指蛋白是真核生物中较为丰富的一类转录因子，在植物的生长发育及非生物胁迫调节中发挥重要的调控作用[1～2]。 拟南芥锌指蛋白基因STZ、ZAT18 被证实积极参与植株的干旱胁迫响应[3～4]。 张彬等对谷子锌指蛋白基因SiZFP182 的研究发现，该基因的表达受干旱胁迫的诱导[5]。 在大豆中过量表达锌指蛋白基因SCTF-1，转基因株系的耐冷性得到显著提高[6]。 过量表达玉米锌指蛋白基因ZmAN14 的烟草，其苗期的耐盐性及耐旱性都得到明显提升[7]。 此外，锌指蛋白基因还被发现与多种非生物胁迫相关。 宁露云等研究发现，矮牵牛锌指蛋白基因PhTZF1 的表达受低温、干旱、ABA 和高盐等强烈诱导[8]。 Mukhopadhyay 等研究证实水稻锌指蛋白基因OsSAP1 的表达受低温、高盐、重金属、干旱和激素ABA 等条件的诱导，且过量表达OsSAP1 基因的烟草，其耐冷、耐盐及耐干旱水平显著提高[9]。 而水稻OsZAT12基因的过表达，转基因株系的生长发育会受到影响[10]。

类LSD1 转录因子是一类特殊的C2C2 型锌指蛋白，其特征是含有特殊的锌指结构(zf-LSD)[11]。 自从Dietrich 首次将LSD1 基因克隆后，对LSD1 基因的功能研究就不断被报道[11]。Kliebenstein 等的研究表明LSD1 能通过应答水杨酸信号通路清除体内活性氧，间接抑制细胞死亡，暗示LSD1 在植物逆境响应调控的作用[12]。 Liu等发现LSD1 家族中，含有3 个zf-LSD1 结构域的亚家族成员，其功能性要强于含有1 个或者是2个zf-LSD1 结构域的亚家族成员，主要的表现是能更多的参与植物细胞死亡调控、抗病性和非生物胁迫抗性调节[13]。 对苦荞类LSD1 转录因子的表达分析显示，锌指蛋白基因FtLSD1、FtLOL1 对非生物胁迫的应答强烈[14～15]，猜测该基因可能参与苦荞抗逆响应机制。 水稻OsLOL2 在拟南芥中的过表达研究表明，该类LSD1 基因具有提高植物抗盐碱性的功能[16]。

长江大学农学院前期克隆了调控玉米转脂蛋白基因ZmLTP3 表达的锌指蛋白类转录因子[17]，并命名为ZmLSD1(GenBank: MH119132. 1)。 该基因长660 bp，编码219 个氨基酸，含有3 个zf-LSD1 结构域，进化关系上与高粱LOL3 蛋白和水稻LOL3 蛋白有较高的亲缘关系。 为深入探究锌指蛋白基因ZmLSD1 的功能，本研究首先对ZmLSD1 进行生物信息学分析，同时运用qRTPCR 技术分析该基因在高温、低温、盐、干旱、脱落酸以及水杨酸处理下的表达特性。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

玉米B73 自交系，长江大学农学院保存。

1. 2 试验方法

1. 2. 1种植与处理 选取大小一致的玉米种子，1%次氯酸钠消毒5 min，蒸馏水冲洗3 次，置于28 ℃培养箱催芽。 筛选发芽一致的种子，放入1/4 Hoagland 培养液水培，每7 d 更换2 次培养液，培养至三叶期进行处理。 干旱处理为20% PEG 6000 模拟干旱，盐处理为0.2 mol/L NaCl 溶液，对照组均为正常培养，处理48 h 后取样；低、高温处理分别采用4 ℃、42 ℃光照培养箱，对照组均为正常温度培养，处理4 h 后进行取样；激素处理采用0.1 mol/L 的ABA、SA 进行叶面均匀喷施，对照组喷施蒸馏水，处理48 h 后取样。 取样部位为幼苗的根、胚芽鞘、叶，液氮速冻后保存于超低温冰箱中；每个处理设置3 个生物学重复。

1. 2. 2玉米总RAN 的提取及cDNA 的合成 样品材料液氮低温研磨后，参照宝日医生物技术(北京)有限公司TRIzol 试剂产品说明方法进行总RNA 的提取，1%琼指糖凝胶电泳进行质量检测。 残留DNA 的去除以及cDNA 合成采用全式金公司试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，得到的cDNA 使用Thermo NanoDrop One 进行浓度测定后暂存于-20 ℃。

1. 2. 3玉米ZmLSD1 基因表达量分析 采用玉米GAPDH 基因为内参，ZmLSD1 基因的qRT-PCR上下游引物通过Primer 5.0 软件设计，引物委托上海生工进行合成(表1)。 试验所使用的SYBR Green I 荧光标记染料购于天根生化公司的Real-Universal 彩色荧光定量预混试剂，荧光定量PCR仪型号为bio-rad CFX connet。 反应条件:98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s；40 个循环。 每个样品设置2 个技术重复，相对定量的结果采用2-△△Ct 法进行计算基因的相对表达量。

1. 2. 4玉米ZmLSD1 基因的生物信息学分析 在线工具Expasy ProtParam(https:/ /web. expasy.org/protparam/)被用于对ZmLSD1 基因蛋白特性进行预测分析，DNAMAN 软件进行序列比对后使用MEGA-X 软件进行进化树的构建，使用在线工具InterProscan[18](http:/ /www. ebi. ac. uk/interpro/search/sequence-search)分析ZmLSD1 蛋白结构域，蛋白二级结构预测分析则采用在线工具 SOPMA (https:/ /npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl? page=npsa_sopma. html)，TMHMM Server v. 2. 0(http:/ /www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/) 被用于跨膜结构分析，ProtScale(https:/ /web. expasy. org/protscale/) 用于分析ZmLSD1 蛋白的亲疏水性分析，NetPhos 3.1 (http:/ /www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/)则用于进行磷酸化位点预测分析。 Softberry 在线工具protcomp9.0(http:/ /www. softberry. com/berry. phtml? topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)进行基因的亚细胞定位。

表 1 引物序列及用途Table 1 Primers used in this study

2 结果与分析

2. 1 玉米ZmLSD1 的蛋白序列分析

ProtParam 在线分析显示，ZmLSD1 基因共编码 219 个 氨 基 酸， 其 分 子 式 为C978H1607N295O306S23，分子质量23 130 u，理论等电点为8.95，总平均亲水性0. 057，亲水性系数介于-0.5 到0. 5 之间，属于两性氨基酸(图1，A)。NetPhos 3. 1 在线分析显示，ZmLSD1 中有20 个Ser 磷酸化位点，9 个Thr 磷酸化位点(图1，B)。

利用InterProscan 对ZmLSD1 蛋白的结构域分析发现，该蛋白中含有3 个zf-LSD1 结构域，分别位于氨基酸51-75、90-114 和128-152 位置。SOPMA 预测结果显示，ZmLSD1 的二级结构中含有的α 螺旋约占10.05%，β 转角约占7.31%，延伸链约占30.14%，其余的115 个氨基酸为无规则卷曲(图1，C)。 Softberry 在线工具进行的蛋白亚细胞定位预测结果显示，该蛋白最大可能性位于细胞核。

2. 2 玉米ZmLSD1 的蛋白同源性及进化树分析

在NCBI 蛋白序列比对的结果表明，ZmLSD1编码的氨基酸序列与高粱(Sorghumbicolor)LOL3蛋白、水稻(OryzasativaJaponica Group)LOL3 蛋白和小麦(Triticumaestivum)LOL2 蛋白序列相似度较高，相似性分别达到了94.83 %、77.96 %和73.60 %。 用DNAMAN 软件将ZmLSD1 蛋白序列与其它物种进行蛋白同源性比对分析(图2)，结果显示ZmLSD1 与高粱、水稻、小麦、荞麦以及拟南芥的锌指蛋白存在类似结构，其序列中均含有3 个保守的zf-LSD1 结构域，表明ZmLSD1 属于典型的锌指蛋白家族，推测它们具有相似的功能。

基因的进化关系分析显示(图3)，ZmLSD1与高粱LOL3、水稻LOL3、水稻LOL2、玉米LOL1和小麦LOL2 的亲缘关系最近。 进化树主要分为3 个分支，LSD1-like 分支中聚集了包括ZmLSD1在内的类LSD1 基因，而拟南芥AtSZF1、水稻Os-DOS 和小麦TaTZF1 共同聚集于CCCH 分支，第三分支(C2H2) 则聚集了棉花GaZFP、拟南芥AtAZF2 和水稻OsZFP182 基因。 进化树成员的氨基酸序列分析发现，不同分支的锌指蛋白含有不同的典型结构域，LSD1-like 分支上LSD1 和LOL 类蛋白含有典型的zf-LSD1 锌指蛋白结构域，而C2H2 分支和CCCH 分支分别含有典型的zf-C2H2 和zf-CCCH 结构域。

2. 3 玉米ZmLSD1 的表达特征分析

2. 3. 1ZmLSD1 的组织表达分析 采用荧光定量PCR 技术分析ZmLSD1 基因在不同部位中的表达情况。 结果表明(图4)，ZmLSD1 的在叶中的表达量最高，其次是胚芽鞘，在根中的表达水平相对较低；该基因在叶中的表达量是根中表达量的3. 18 倍，在胚芽鞘中表达量是根中表达量的1.55 倍。 推断ZmLSD1 基因参与调控表达的部位以叶为主。

2. 3. 2ZmLSD1 在不同处理下的表达分析 利用qRT-PCR 分析ZmLSD1 基因在6 种非生物处理下不同植株部位的表达水平。 根部位的结果如图5 显示，ZmLSD1 基因受低温、高温、高盐、干旱和ABA 处理的诱导而上调表达，其中低温和干旱处理后与对照的相对表达量分别为5. 47、18. 4，达到差异极显著水平；水杨酸处理下该基因的表达量则降低。 胚芽鞘的检测结果表明(图6)，ZmLSD1 基因在盐、干旱以及2 种激素(ABA 和SA)的处理下呈现上调表达趋势，其中干旱胁迫下的相对表达量为8. 21，差异水平极显著；而4 ℃和42 ℃温度处理下该基因的表达受抑制。ZmLSD1 在叶中的表达受盐、干旱和ABA 的影响，其中干旱处理产生的影响最大，而在低温、高温和水杨酸条件下该基因表现为下调表达(图7)。 实验结果显示，ZmLSD1 基因对干旱、盐和ABA 胁迫存在正向响应，而低、高温以及水杨酸环境能抑制该基因的表达，但在不同部位中的敏感程度还是存在一定的差异；该基因在根中对干旱、高温和低温最敏感，在胚芽鞘中的表达受干旱和低温的影响程度最高，在叶中则对盐和干旱敏感。 结果表明ZmLSD1 的表达受干旱、盐、高温和低温胁迫的诱导，推断该基因可能参与干旱、盐、高温和低温等非生物胁迫的响应。

3 结论与讨论

干旱、盐等非生物胁迫严重影响作物的生长发育，是限制作物产量的主要因素之一[19]。 研究发现锌指蛋白转录因子在植物的生长发育以及逆境胁 迫 下 的 调 控 表 达 发 挥 着 重 要 作 用[4，20～21]，LSD 类锌指蛋白广泛参与植物生物及非生物逆境信号传导过程[22]，其典型的特征是形成锌指结构并在蛋白质调控中发挥作用[23]。 大量研究表明，含有3 个zf-LSD1 结构域的锌指蛋白基因在逆境响应过程中发挥重要作用[14～16，24]；ZmLSD1 也含有3 个zf-LSD1 结构域，进化分析发现其与水稻OsLSD1、玉米ZmLOL1、拟南芥AtLSD1 等蛋白有较高的同源性，属于典型的锌指蛋白家族成员。

本研究发现玉米锌指蛋白基因ZmLSD1 受植物非生物胁迫的诱导表达，如干旱、盐、高温和低温等。 在干旱和盐处理后，ZmLSD1 基因在根、胚芽鞘和叶中的表达量均呈现上调表达趋势，说明该基因的表达受干旱和盐的诱导。 这与香蕉MaZAT10 基因的表达模式一致，香蕉C2H2 型锌指蛋白基因MaZAT10 受干旱、盐和低温处理的诱导而显著上调表达[25]。 基于温度(4 ℃、42 ℃)处理的研究发现，ZmLSD1 基因在胚芽鞘和叶部位的转录表达水平受抑制。 该基因对冷、热胁迫的响应与苦荞FtLOL1、水稻OsBBX6 存在一定的相似性，苦荞锌指蛋白基因FtLOL1 在4 ℃的低温胁迫和水杨酸处理下表达量降低[15]，水稻锌指蛋白基因OsBBX6 则被发现负向响应高温胁迫[26]。ZmLSD1 基因在脱落酸处理下上调表达，说明ZmLSD1 基因可能是通过ABA 信号路径介导植物的逆境响应。 而在水杨酸的处理下，ZmLSD1基因在根和叶部位中的表达量下降。 这与拟南芥锌指蛋白基因AtLSD1 的表达趋势相反，AtLSD1基因通过积极响应SA 信号，提升活性氧的清除以降低非生物胁迫的伤害[27]。

玉米锌指蛋白基因ZmLSD1 对不同的非生物处理表现出不同的表达特征，可能是该转录因子的DNA 结合差异或蛋白互作差异产生的结果，说明ZmLSD1 与玉米逆境响应的密切相关，但其确切的生物学功能，有待于进一步研究。