正弦波交变电磁场对2型糖尿病皮肤软组织创伤愈合修复的研究*

郭毅敏，汪天赐，蔡 婧，葛淑华△

1.空军军医大学第一附属医院 呼吸内科(西安 710032)；2.空军军医大学 军事生物医学工程学系(西安 710032)

2型糖尿病是一种以胰岛素分泌相对不足或胰岛素抵抗所引起机体血糖升高的慢性疾病，多发于40岁以上群体，占糖尿病总人数的90%以上。2型糖尿病会引起机体诸多系统产生严重并发症，如心血管系统、神经系统、泌尿系统等[1-2]。而糖尿病创伤愈合障碍也是2型糖尿病最常见的并发症之一，临床上2型糖尿病患者通常由于微小组织创伤的形成，诱发溃疡、感染、坏疽甚至截肢[3]。数据[3-4]显示，有超过20%的2型糖尿病患者会出现非治愈性糖尿病足溃疡。糖尿病创伤愈合障碍严重危害2型糖尿病患者的生理和心理健康，并极大增加了2型糖尿病的致残率和致死率。因此，目前亟待探索开发更多安全且有效的促进2型糖尿病组织损伤修复障碍的治疗方法。

大量研究[5-6]揭示，电磁场治疗对于加速骨折愈合、改善机体微循环和促进软组织损伤修复具有积极的作用效果，电磁治疗也凭借其经济、安全、无创等优势，已成为近年来临床康复物理治疗的常见方法。电磁场波形众多，而文献[7-8]报道的对于机体具有积极作用效果的主要包括脉冲电磁场、稳恒磁场和正弦波交变电磁场(sinusoidal electromagnetic fields，SEMF)。在众多电磁场类型中，交变磁场因其可直接由市电转换，故具有最易获取的特性，而SEMF对正常和1型糖尿病软组织创伤愈合有积极作用的效果也得到了证实。但是，2型糖尿病与1型糖尿病的发病机制具有较大差异，而SEMF是否能够促进2型糖尿病软组织创伤修复，目前国内外尚未见相关文献报道。本研究使用2型糖尿病的db/db小鼠动物模型，系统探究SEMF暴露对db/db小鼠创伤愈合率、组织力学属性、伤口组织微循环状态以及重要细胞因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

3月龄雄性2型糖尿病db/db小鼠(C57BKS背景，BKS.Cg-m+/+Leprdb/J)及与其同背景的野生型小鼠，购于美国Jackson实验室；戊巴比妥钠麻醉液，购于美国Sigma公司；便携式血糖仪，购于美国强生公司；Tegaderm透明伤口敷料，购于美国3M Health Care公司；生物组织力学测试系统，购于东莞昆仑仪器有限公司；数码照相机，购于日本佳能公司；高斯计，购于美国Lakeshore公司；激光多普勒血流测量仪及其配套的皮肤接触探头，购于英国Moor Instruments公司；ELISA试剂盒，购于武汉华美生物公司；SEMF发生系统，课题组自制；有机玻璃小鼠饲养笼(电磁生物效应研究专用)，课题组自制。

1.2 实验分组与软组织创伤模型构建

全部动物进入本实验室后，饲养于温度(22～24 ℃)、湿度(50%～60%)和光照(12 h/12 h光-暗循环)精确可控的实验环境中。所有小鼠在实验全过程中保证能够自由进食和饮水。随后，于清晨通过尾静脉抽取全部小鼠静脉血，使用便携式血糖仪测量db/db小鼠的随机血糖值，血糖值>16.7 mmol/L的小鼠被认定符合2型糖尿病标准，用于后续实验。整个实验共分成3组，即Wild type野生型小鼠组(Control)、db/db小鼠组(db/db)及db/db施以SEMF刺激组(db/db+SEMF)，每组各16只小鼠。于3组小鼠背部构建软组织创伤模型，实验步骤为：对各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，使用皮肤活检针在小鼠背部构建直径1 cm的圆形伤口，充分分离皮肤、皮下组织和肌纤维膜组织，并覆盖以Tegaderm伤口敷料，以保持伤口湿润。术后注射青链霉素合剂，预防伤口感染。分别于软组织创伤建立后的第5、12、19天处死每组4只小鼠，每组剩余4只小鼠用于观察伤口完全愈合的时间。db/db+SEMF组小鼠在创伤模型构建后，立即施以全身SEMF暴露，每天治疗2 h。本研究中的动物实验操作全部由空军军医大学实验动物伦理学委员会授权批准。

1.3 SEMF发生装置

SEMF发生装置为本课题组自行设计研制，整个系统主要包括电磁信号发生器和Helmholtz线圈系统两部分[9-11]。电磁信号发生器以STC5410单片机为核心，能够输出低功率的各波形弱电信号(如正弦波、三角波、脉冲波等)。本实验中输出波形为50 Hz的正弦波信号，该弱电信号经功率放大芯片OPA549调制滤波放大后输入至Helmholtz线圈组。Helmholtz线圈组由3个同轴放置的Helmholtz线圈(直径80 cm)构成，彼此相距30.4 cm，中心线圈和外部线圈的匝数分别为266和500，该三线圈结构比两个线圈的组装具有更高的磁场均匀性[9]。小鼠饲养于自制的塑料笼中，将塑料笼放置于Helmholtz线圈中，塑料笼的底部与线圈中心对齐，以确保小鼠位于磁场中心位置。使用高斯计测量线圈中小鼠获得区域的磁场强度，测得磁场空间分布范围为1.5～2.0 mT。

1.4 伤口组织血流速率检测分析

分别于创伤模型构建的第5、12、19天在各组小鼠处死前，使用激光多普勒血流测量仪检测各组小鼠背部伤口位置的血流速率。将激光多普勒探头置于伤口正中心位置，激光探头由激光发射器通过发生纤维将780 nm波长的激光照射至组织，通过探头内的接收纤维阵列将频移后的光信号以40 Hz 采样率采集至多普勒系统中，最后测量得到微血管的血流速率信息。

1.5 伤口闭合率检测分析

分别于创伤模型构建第0、5、12、19天使用数码照相机拍摄各组小鼠背部伤口愈合情况。使用戊巴比妥钠麻醉每组4只小鼠，待充分麻醉后将动物固定于观察台，数码照相机置于小鼠正上方20 cm处，随后对伤口进行照相。随后对数码照片使用课题组自行编制的Matlab程序对伤口进行自动识别(基于颜色阈值、边缘提取等图像分析算法)，并对伤口面积进行量化分析。以伤口闭合率作为评估伤口愈合情况的标准，伤口闭合率的计算公式如下：伤口闭合率=(第0天的原始伤口面积-第n天的伤口面积)/第0天的原始伤口面积。对于每组最后剩余的4只小鼠观察创伤完全愈合所需时间。

1.6 伤口组织抗张强度和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测分析

在每个时间点动物处死后，组织样本被分切成两块。一块用于生物力学测试，另一块用于ELISA检测。将用于评估伤口抗张强度的组织样本修剪成8 mm×8 mm的方形条带。进行力学测试前始终将样品浸于生理盐水溶液中，采用生物力学材料测试系统对伤口软组织进行力学拉伸测试。皮肤条固定于力学测试系统的两个夹具之间，伤口处位于两夹具中线处。随后通过对两夹具施以20 mm/min的恒定位移进行移动，对组织施加轴向拉伸应力，直至样本出现最终的完全破裂，记录最大断裂载荷。伤口附近用于生物力学测试剪割后剩余的软组织用于ELISA检测。ELISA检测使用武汉华美生物公司的ELISA商业试剂盒，检测指标分别为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素1(Angiopoietin1，Ang1)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，所有实验操作按照试剂盒说明严格执行。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 全身SEMF刺激对db/db小鼠血糖和体重的影响

db/db组小鼠在术后第5、12、19天的血糖分别为(21.5±2.6)、(19.8±2.1)、(20.6±2.7)mmol/L，db/db+SEMF组小鼠术后各时间点血糖分别为(22.4±4.2)、(20.2±4.5)、(21.3±4.6 )mmol/L，两组小鼠血糖值均高于对应时间点的Control组小鼠(P<0.05)。db/db组小鼠在术后第5、12、19天的体重分别为(42.5±4.7)、(44.6±5.5)、(45.1±6.1)g，db/db+SEMF组小鼠术后各时间点体重分别为(43.3±4.7)、(44.8±5.8)、(46.9±5.4)g，两组小鼠体重也均高于对应时间点的Control组小鼠(P<0.05)。但是，db/db组小鼠与db/db+SEMF组小鼠在术后第5、12、19天的体重和血糖比较差异无统计学意义(P>0.05)。由此得出，SEMF暴露的全过程并未对2型糖尿病db/db小鼠的血糖和体重产生明显影响(图1)。

注：A：各组小鼠体重比较；B：各组小鼠血糖比较；与Control组比较，*P<0.05

2.2 全身SEMF刺激对db/db小鼠伤口闭合率和总愈合时间的影响

2型糖尿病的db/db组小鼠在软组织创伤模型构建后第5、12、19天的创伤闭合率分别为(10.1±2.0)%、(39.1±5.2)%及(59.2±6.2)%，而Control组小鼠的伤口闭合率分别为(22.1±2.9)%、(60.3±4.5)%及(85.4±5.9)%，db/db组的伤口闭合率在各时间点均低于Control组(P<0.05)。而db/db+SEMF组小鼠术后各时间点的伤口闭合率分别为(20.7±3.6)%、(56.9±4.2)%及(80.6±4.1)%，均高于对应时间点db/db组的伤口闭合率(P<0.05)。2型糖尿病的db/db组小鼠的软组织创伤总愈合时间(39.9±5.4) d，高于Control组小鼠(22.9±4.3) d(P<0.05)，而SEMF刺激降低了db/db小鼠的创伤总愈合时间(P<0.05)，将db/db小鼠伤口愈合时间降低了33.6%(图2)。

注：A：各组小鼠各时间点伤口愈合照片；B：各组小鼠伤口闭合率比较；C：各组小鼠伤口总愈合时间比较；与Control组比较，*P<0.05 ；与db/db组比较，#P<0.05

2.3 全身SEMF刺激对db/db小鼠伤口组织抗张强度的影响

2型糖尿病的db/db组小鼠在术后的第5、12、19天的伤口组织抗张强度分别为(4.5±0.9)、(7.8±1.0)、(10.2±1.5) kg/mm2，而Control组分别为(9.5±1.1)、(14.2±2.0)、(18.3±2.1) kg/mm2，db/db组的伤口组织抗张强度在各时间点均低于Control组(P<0.05)。而与db/db组比较，SEMF暴露增加了db/db组小鼠伤口组织抗张强度(P<0.05)，分别在术后的第5、12、19天将db/db小鼠伤口组织抗张强度增加了95.3%、66.1%、65.3%(图3)。

2.4 全身SEMF刺激对db/db小鼠伤口组织血流速率的影响

与Control组小鼠相比，2型糖尿病的db/db组小鼠伤口位置的血流速率明显降低(P<0.05)，提示2型糖尿病db/db小鼠的损伤位置表现明显的微循环障碍。而db/db+SEMF组小鼠伤口位置的血流速率在术后各时间点均明显高于db/db小鼠(P<0.05)，分别将db/db小鼠伤口位置的血流速率增加了82.4%、217.9%、126.5%(图4)。

2.5 全身SEMF刺激对db/db小鼠伤口组织中重要细胞因子表达的影响

db/db组、db/db+SEMF组小鼠在术后各时间点伤口组织的IL-1β的表达高于Control组(P<0.05)，但db/db+SEMF组与db/db组小鼠伤口组织的IL-1β的表达差异无统计学意义(P>0.05)。与Control组小鼠相比，db/db小鼠在术后各时间点伤口组织的VEGF、Ang1和IGF-1表达降低(P<0.05)。而SEMF刺激在术后各时间点均增加了db/db小鼠伤口组织中VEGF、Ang1和IGF-1的蛋白表达(P<0.05)(图5)。

图5 通过ELISA检测SEMF刺激对db/db小鼠伤口组织中重要细胞因子表达的影响

注：A：各组小鼠IL-1β表达比较；B：各组小鼠VEGF表达比较；C：各组小鼠Ang1表达比较；D：各组小鼠IGF-1表达比较；与Control组比较，*P<0.05 ；与db/db组比较，#P<0.05

3 讨论

大量研究[12-13]揭示，非热性的电磁场刺激能够明显促进正常组织的创伤愈合，加速溃疡修复，而非热性的低强度电磁场刺激也被发现能够促进链脲佐菌素诱导的1型糖尿病的软组织创伤愈合。但是，作为各种电磁场类型中最易获得的SEMF波形，其是否能够对2型糖尿病软组织创伤愈合产生积极作用效果，国内外尚未见研究报道。db/db小鼠作为瘦素受体基因(db)纯合突变的小鼠，在出生约半月后即表现出多食、多饮、多尿、血糖升高、胰岛素抵抗等2型糖尿病症状，且其高血糖症状可贯穿其生命全过程。db/db小鼠也被广泛用于2型糖尿病及其并发症的实验研究，被认为是迄今最为理想的2型糖尿病研究的动物模型[14-16]。在本研究中，并未发现SEMF对db/db小鼠的体重和血糖有明显影响，提示SEMF并未对2型糖尿病产生改善效应。

伤口愈合是一个复杂的动态修复过程，涉及到急性炎症期、细胞增生期、瘢痕形成期和表皮组织再生期4个关键阶段。而2型糖尿病对于以上4个过程均能够产生明显的破坏效应，从而导致组织创伤修复能力的受损和组织愈合障碍[17]。本实验发现，2型糖尿病的db/db小鼠在软组织创伤模型构建的第5、12、19天伤口愈合率均低于非糖尿病的Control组，且db/db小鼠的创伤总愈合时间高于Control组小鼠，提示创伤软组织的正常修复进程在2型糖尿病环境下被破坏。结果进一步揭示，SEMF刺激在术后的第5、12、19天均明显提升了db/db小鼠的创伤愈合率，且缩短了db/db小鼠的创伤总愈合时间。本研究结果表明，SEMF对于加速2型糖尿病db/db小鼠的软组织损伤修复具有积极作用。

皮肤组织的生物力学抗张强度是反映软组织修复质量的重要指标，它能够反映表皮组织的黏弹性属性，体现出胶原蛋白的数量和胶原纤维的排布规律[18]。本研究发现，正常软组织在修复过程中其生物力学抗张强度呈现逐渐增加的变化趋势，而2型糖尿病db/db小鼠的抗张强度在术后的第5、12、19天均低于Control组，提示2型糖尿病破坏了软组织中的胶原蛋白累积与排布，从而使其力学属性发生衰退，而这一效应很可能与糖基化终末产物的累积具有重要关联[19]。结果进一步揭示，SEMF暴露在术后的第5、12、19天均明显提升了db/db小鼠的抗张强度，提示SEMF对抑制2型糖尿病诱发的胶原组织破坏和弹性力学属性衰退具有积极效应。

血管新生及其局部微循环畅通是保证创伤软组织修复正常进行的必要条件，而糖尿病所诱发的血管新生和局部微循环障碍也被认为是2型糖尿病组织损伤修复能力衰退的关键因素[20]。在本研究中，激光多普勒血流测量结果揭示了db/db小鼠创伤位置的局部血流速率低于非糖尿病的Control组小鼠，提示2型糖尿病的db/db小鼠出现了微循环障碍。同时，ELISA结果也表明，VEGF和Ang1两个反映血管新生的重要细胞因子，db/db小鼠创伤位置的表达量低于Control组小鼠，该结果提示2型糖尿病db/db小鼠创伤组织周围的血管新生能力同样被破坏。而IGF-1作为一种活性蛋白多肽物质，具有舒张血管和促进组织修复和细胞再生的作用[21]。本研究揭示，db/db小鼠创伤组织周围的IGF-1表达含量低于Control组小鼠，进一步提示了2型糖尿病对组织修复和血管新生能力的破坏效应。同时，本研究也发现，db/db小鼠创伤软组织中的促炎性反应因子IL-1β含量高于Control组小鼠，提示2型糖尿病创伤修复处于高炎性反应状态。更重要的是，本研究发现了全身SEMF刺激在术后的第5、12、19天均能够增加db/db小鼠创伤组织位置的血流速率并促进了VEGF、Ang1和IGF-1的蛋白表达，提示SEMF具有促进2型糖尿病损伤软组织处的血管新生和改善局部微循环的功效。但是，SEMF在各时间点并未对2型糖尿病创伤组织中IL-1β的表达产生影响，提示SEMF可能并不具有明显的抗炎性反应效应。

综上所述，本研究系统揭示了全身性的SEMF暴露能够加速2型糖尿病db/db小鼠的创伤修复进程并改善db/db小鼠的皮肤力学属性，而这一积极的治疗效果与SEMF对db/db小鼠血管新生和局部微循环的改善有关。