一例孔雀大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验分析

李佳璇 王洪利 亓爱杰 孙圣福 蔺晓月 邢林林 王苗利 陈静

摘  要：2018年12月份，滨州市某孔雀养殖场的部分孔雀出现了咳嗽、肿脸、粪便发绿发黑等情况，场主给发病孔雀用了多种抗生素，疗效均不明显，且该场孔雀自首例发病已两个月，累计死亡20多只，还有100只正在发病，基本都是小孔雀。实验室接到病例后立即采样，进行病毒PCR检测、细菌分离纯化培养、生化鉴定和药敏试验，结果显示禽流感、新城疫、传染性支气管炎均为阴性，仅分离到大肠杆菌，药敏试验结果显示该大肠杆菌敏感的药物为头孢类药物，根据此结果指导该场临床科学用药，取得了良好的治疗效果。

关键词：孔雀;大肠杆菌;细菌分离鉴定;药敏分析;耐药性;临床用药

中图分类号：S858.39     文献标识码：C     文章编号：1673-1085（2020）3-0043-04

大肠杆菌（Escherichia coli），又称大肠埃希菌，为两端钝圆的短杆菌，是革兰氏阴性菌，无芽孢，大多数大肠杆菌菌株有荚膜或微荚膜结构，多数有菌毛[1]。大肠杆菌正常寄居于动物肠道中，但其中小部分可在一定条件下致病，如在动物体免疫力下降时，主要是由特定的菌毛抗原等感染引起人或动物胃肠道疾病，此外，还可引起尿道感染、关节炎等[2]。

当禽类机体防御能力下降时，常引起继发性局部或全身感染。禽致病性大肠杆菌是危害养禽业的重要病原。该病原能够引起禽类多种肠道和体外疾病，还能够引起鸡与鸭的败血症、气囊炎和腹膜炎，以及鹅的生殖器官感染等，造成肉禽质量降低，蛋禽产蛋下降，给养禽业带来严重的损失[3]。

1  临床调查情况

2018年12月份，滨州市某孔雀养殖场部分孔雀出现了咳嗽、肿脸、粪便发绿发黑的情况，畜主给病禽使用过泰乐菌素、泰妙菌素、氟苯尼考、替米考星等抗生素，效果均不明显。该孔雀养殖场已发病2个月，死亡了20多只，还有100只孔雀正在发病，但是种孔雀基本正常，发病死亡的均为小孔雀。经过进一步了解，该场孔雀平均年产蛋为30枚/只，孵化需28d，孵化率为70%，孔雀每天吃100g饲料。实验室接到孔雀场主送来的死孔雀样本后，立即采样，用肝脏和肺脏作为样本进行实验室检测。

2  试验材料与方法

2.1  主要材料

2.1.1  主要仪器设备  罗氏荧光定量PCR仪，科马嘉显色培养基，奥林巴斯显微镜，移液器（0～300μl），梅里埃生化及药敏仪VITECⅡcompact60，生物安全柜。

2.1.2  试剂盒  禽传染性支气管炎病毒（AIBV）核酸检测试剂盒（荧光-PCR法），购自广州维伯鑫生物科技有限公司;禽流感病毒病原荧光PCR检测试剂盒，购自北京森康生物技术开发有限公司;鸡新城疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

2.1.3  主要试剂  梅里埃生化鉴定卡片，梅里埃药敏鉴定卡片，营养琼脂，革兰氏染色液，酒精，碘酊，0.45%氯化钠溶液。

2.2  试验方法

2.2.1  病毒检测  将病料剪下一小块，研磨，加入PBS缓冲液，放于离心管内，在离心机内转速8000r/s离心2min。在生物安全柜内操作，取上清液加入到深孔板中，用罗氏自动核酸提取仪提取核酸。根据试剂盒使用说明配置反应液，将核酸与反应液混合，放入罗氏荧光定量PCR仪，根据试剂盒说明书设定PCR循环参数，1h后读取结果。

2.2.2  病料接种与培养  点燃酒精灯，无菌环境操作，取病变较为严重的肝脏作为接种病料，选取病变部位和健康部位交界处，表面用酒精棉球和碘酊棉球消毒三遍，取小剪刀，先于酒精灯上烧烙，然后在病料表面按压，使剪刀降温。接着在选定好的区域内剪开一个小口，用无菌棉棒伸到小口中蘸取病料，使用三劃线法，于显色培养基上划线接种，注意每划一次线就要更换一次无菌棉棒。接种完成后，将培养基倒置，放于志贺氏厌氧培养箱中，37℃培养24h。

2.2.3  细菌的染色及镜检  在洁净的载玻片上滴一滴清水，用接种环挑取显色培养基上的菌落溶解于载玻片上的清水中，置于酒精灯上进行加热固定，此步骤注意温度不可过热，固定好后进行革兰氏染色，染色步骤为：初染用草酸铵结晶紫溶液染色1.5min，用温和的水流冲洗;媒染用革兰氏碘液染色1.5min，用温和的水流冲洗;脱色用95%的乙醇溶液脱色45s，用温和的水流冲洗;复染用复红溶液染色20s，用温和的水流冲洗。将载玻片自然晾干或置于酒精灯上微微加热烤干，将松柏油滴加在染色区域内，置于100倍油镜下观察。

2.2.4  细菌的分离及纯化培养  根据显色培养结果及镜检结果，用接种环挑取单个菌落，在营养琼脂平板上划线接种，将平板倒置，放于志贺氏厌氧培养箱中，37℃培养24h。

2.2.5  生化鉴定及药敏分析  观察纯化结果，营养琼脂平板放入生物安全柜，根据革兰氏染色结果选择合适的生化鉴定卡片和药敏分析卡片，准备无菌棉棒若干，配好的0.45%氯化钠溶液一瓶，小试管两支置于生物安全柜中。开始制备菌悬液，在卡架上放上两支小试管，各加入无菌0.45%氯化钠溶液3ml，用无菌棉棒挑取纯化培养的单菌落于氯化钠溶液中接种，使其浓度保持在0.56～0.83Mc，插入生化鉴定卡片。用移液器吸取接种好的菌悬液145μl，接种到新的装有0.45%氯化钠的小试管中，抽吸均匀，并插入药敏分析卡片，上机，待18h后读取结果。

3  结果与分析

3.1  病毒检测结果  根据罗氏荧光定量PCR仪给出的图像以及ct值结果，我们可以得知，鸡传染性支气管炎、禽流感和新城疫检测结果均为阴性。

3.1  病料接种及培养结果  将显色平板从志贺氏厌氧培养箱中取出，可以观察到平板上有一种粉紫色菌落生长。

3.2  细菌的染色及镜检结果  通过100倍油镜观察革兰氏染色结果，观察到红色、两端钝圆的短杆菌，为革兰氏阴性杆菌。

3.3  细菌生化鉴定及药敏分析结果  根据以上结果，选择GN生化鉴定卡片和GN13药敏分析卡片，将卡片装备在已经接种好的菌悬液中，放入生化及药敏仪，经过18h的生化鉴定及药敏分析，得出生化鉴定结果及敏感药物，其生化鉴定结果见表1，药敏分析结果见表2。

根据表1可得出，该生化鉴定结果符合大肠杆菌生化图谱，鉴定结果为大肠杆菌，是置信度好的鉴定结果，其符合率是91%。

根据表2中MIC血药浓度及其解释可得出，该孔雀养殖场的大肠杆菌的敏感药物为厄他培南和头孢类药物，首选药物是头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟，可以交替或混合使用，避免产生耐药性。

4  讨论

病毒检测和细菌分开鉴定结果显示：该孔雀养殖场是单一大肠杆菌感染引起的疾病。结合药敏试验以及MIC血药浓度值可以得出头孢类药物是治疗此孔雀场大肠杆菌病的首选药物，并且要控制血药浓度，防止抗生素滥用。考虑到细菌可能会出现耐药性，建议该孔雀场场主将头孢他啶等药物混合或交替使用。大肠杆菌可以在机体抵抗力下降时引起动物体发病[2]，还与养殖场饲养环境密切相关，因此建议该养殖场场主注意养殖场内卫生，及时清理粪便及病死孔雀的尸体，进行无害化处理，舍内、外定期消毒，注意通风，注意孔雀饲料及饮水健康，强化孔雀场的科学管理，严格管控场内饲养人员及外来人员流动，防止外部人員将病菌带入场内。近年来，大肠杆菌的耐药图谱不断扩大，呈现多重耐药趋势[4]，因此，对于大肠杆菌病

最好的防控措施为预防，科学合理地管理养殖场，改善饲养环境，从而减少大肠杆菌感染。若出现大肠杆菌感染，要及时送检，在实验室诊断和药敏分析结果的指导下，科学地、合理地临床用药。

参考文献：

[1]  陆承平.兽医微生物学[M].第5版.北京：中国农业出版社，2016：94-95.

[2]  殷泽禄，万虎.大肠杆菌的研究综述[J].甘肃畜牧兽医，2019（5）：33-35.

[3]  王怡平，孙畅，赵丽丽，陈洪岩.鉴别禽致病性大肠杆菌与禽非致病性大肠杆菌的多重PCR检测方法的建立及初步应用[J].中国兽医科学，2018，48（11）：1358-1364.

[4]  王影，李欣南.大肠杆菌耐药性产生与传播机制研究现状[J].现代畜牧兽医，2016，（1）：32-36.

基金项目：山东省家禽产业体系创新团队：SDAIT-11-13。

通讯作者：王苗利，（1987.07-），中级兽医师，主要从事动物疫病检测、流行病学、环境微生物方向的工作，E-mail：wangmiaoli1987711@163.com;并列通讯作者：陈静（1968-），研究员，山东省家禽产业体系省综合试验站站长，主要从事动物疫病快速诊断、疑难病症确诊、疫情监测和疫病普查、动物流行病学调查、实验室管理、兽医新技术培训与推广及实用防治技术研究等工作，E-mail：1752058646@qq.com。