长链非编码RNA RAB11B-AS1在膀胱癌组织中的表达及与预后的关系

金 松 仓 宇 于跃平

作者单位：650021 昆明 云南省第二人民医院泌尿外科

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，近年来发病率和死亡率均呈上升趋势［1-2］。膀胱癌预后较好，但易复发及发展成肌层浸润性膀胱癌（muscular invasive bladder cancer，MIBC）。而 MIBC侵袭和转移能力较强，预后较差，5年生存率不足50%［3-4］。反义长链非编码RNA（anti-sense long non-coding RNA）是一类长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA），较其他类型的lncRNA稳定，定位更自由［5-6］。有研究报道，特定的lncRNA在膀胱癌中表达异常，且与膀胱癌发生、转移及预后有关［7］。反义长链非编码RNA作为一种特定的lncRNA，能通过不同机制调控基因表达。lncRNA RAB11B-AS1是一种反义lncRNA，定位于19q13.2，长1022 bp，是具有3个外显子的lncRNA，目前研究显示lncRNA RAB11B-AS1在多种肿瘤中发挥抑癌或致癌作用［8］。但lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌中的作用尚未明确。本研究检测lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌组织中的表达，并分析其与患者临床病理特征及预后的关系，以期为膀胱癌的预后判断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年10月—2014年2月于云南省第二人民医院泌尿外科行腹腔镜膀胱根治性切除术的膀胱癌患者作为研究对象，收集膀胱癌组织及相应癌旁正常组织（距病灶＞5 cm且镜检未发现癌细胞）。纳入标准：⑴根据中华医学会膀胱癌的诊断标准［9］诊断为膀胱癌；⑵术前未行放疗或化疗；⑶临床病理资料完整。排除标准：⑴合并其他恶性肿瘤者；⑵合并肝、肾、心脏等疾病者；⑶合并自身免疫疾病者；⑷复发性膀胱癌者。共83例患者符合标准纳入分析，其中男性59例；年龄37～75岁，平均年龄（54.31±7.86）岁。按照《膀胱癌诊断治疗指南》临床TNM分期标准：非肌层浸润性膀胱癌（non-muscular invasive bladder cancer，NMIBC）Tis～T1 期 35 例，MIBC T2～T4期48例；低分化46例，中、高分化37例。本研究经云南省第二人民医院伦理委员会审核批准，患者及家属知情同意。

1.2 qRT-PCR法检测膀胱癌组织中lncRNA RAB11BAS1的表达

RNA提取试剂盒及反转录试剂盒均购自北京天根生化有限公司；qRT-PCR试剂盒购自德国QIAGEN公司；Bio-Rad PCR仪购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，检测RNA纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整度；将所得RNA按照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA，产物置于-20℃冰箱保存备用。qRT-PCR按照qRT-PCR 试剂盒说明书进行，反应体系（20 μL）：10 μL 2×SYBR Mix，上、下游引物各 1 μL，cDNA 模板 1 μL，dH2O 7 μL，每个样品重复3次。反应条件：95℃30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃延伸 10 min。lncRNA RAB11B-AS1 上游引物：5′-CCATGGACCCTTGCGAGAT-3′，下游引物：5′-CAAAGTCCATGTAAACATGTTCCC-3′。以GAPDH为内参，GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCTTACTTCTCATGG-3′。采用 2-ΔΔCt法计算lncRNA RAB11B-AS1的相对表达量。

1.3 观察指标及随访

收集患者性别、年龄、TNM分期、肿瘤大小、组织学分级和淋巴结转移状况等临床资料，并通过电话或邮件随访，每隔3个月随访1次，随访截至2019年3月，记录患者的生存状态及总生存时间。中位随访时间48个月，无失访病例。总生存期定义为自确诊至随访截止日期或死亡的时间。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；分类资料用n（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier法计算生存率，组间比较采用Log-rank检验；采用多因素Cox回归分析lncRNA RAB11B-AS1表达水平与预后的关系；以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌和癌旁正常组织中lncRNA RAB11B-AS1的表达

qRT-PCR检测结果显示，lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织（1.17±0.32 vs 2.09±0.74，t=10.396，P＜0.001），见图 1。

图1 lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的表达Fig.1 Expression of lncRNA RAB11B-AS1 in bladder cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 lncRNA RAB11B-AS1表达水平与膀胱癌患者临床病理特征的关系

根据lncRNARAB11B-AS1表达水平的中位数（1.20）将患者分为高表达组（≥1.20）和低表达组（＜1.20），其中lncRNA RAB11B-AS1表达水平与TNM分期、组织学分级和淋巴结是否转移有关（P＜0.05），但未发现其与患者年龄、性别和肿瘤大小有关（P＞0.05）。见表1。

表1 lncRNA RAB11B-AS1表达与膀胱癌患者临床病理特征的关系［n（%）］Tab.1 Relationship between the expression of lncRNA RAB11B-AS1 and clinicopathological characteristics in bladder cancer patients［n（%）］

2.3 lncRNA RAB11B-AS1表达水平与膀胱癌患者总生存期关系

83例膀胱癌患者至随访结束共生存39例，5年总生存率为46.99%。lncRNA RAB11B-AS1高表达患者术后5年总生存率为62.22%，低表达患者为26.32%；两组患者生存曲线比较，差异有统计学意义（χ2=13.420，P＜0.001）。见图 2。

2.4 影响膀胱癌患者预后的因素分析

单因素Cox回归分析显示，lncRNA RAB11B-AS1表达、TNM分期、组织学分级和淋巴结转移与膀胱癌患者预后有关（P＜0.05），见表2。多因素Cox回归分析显示，lncRNA RAB11B-AS1低表达是膀胱癌患者预后的独立危险因素（HR=1.126，95%CI：1.058～1.200，P＜0.001），见表 3。

图2 lncRNA RAB11B-AS1高表达和低表达膀胱癌患者的生存曲线Fig.2 Survival curves of bladder cancer patints with lncRNA RAB11B-AS1 high and low expression

表2 影响膀胱癌患者预后的单因素Cox回归分析Tab.2 Univariable Cox regression analysis of prognosis in patients with bladder cancer

表3 影响膀胱癌患者预后的多因素Cox回归分析Tab.3 Multivariable Cox regression analysis of prognosis in patients with bladder cancer

3 讨论

膀胱癌的发病机制复杂多样，包含遗传因素、基因突变或分子水平的变化等。目前膀胱癌临床诊断中尚缺乏有效的肿瘤标志物，治疗亦未取得明显进展。lncRNA是一类转录本长度＞200 nt的非编码蛋白质RNA分子，可从转录及转录后、表观遗传等多个方面发挥作用，实现对基因表达的调控，在肿瘤细胞发生、侵袭和转移中发挥重要作用［10-11］。反义lncRNA作为一种lncRNA备受关注，可通过调节其正义基因表达，参与肿瘤的发生发展。lncRNA RAB11B-AS1为反义lncRNA，荧光素酶报告基因检测表明，RAB11B-AS1可通过反义配对调控RAB11B基因表达，二者的启动子序列反向互补。RAB11B是RAS癌基因家族成员之一，该基因家族在调控细胞增殖和分化能力中发挥重要作用，具有调控肿瘤细胞浸润、扩散和凋亡的能力［12-13］。有研究发现，lncRNA RAB11B-AS1在骨肉瘤组织中表达下调，而过表达lncRNA RAB11B-AS1可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，lncRNA RAB11B-AS1可能成为骨肉瘤的潜在治疗靶标［14］。NIU 等［15］报道lncRNA RAB11B-AS1 表达水平与肿瘤血管生成及乳腺癌转移有关。本研究检测膀胱癌患者癌组织中lncRNA RAB11B-AS1的表达，亦发现lncRNA RAB11B-AS1在癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，且lncRNA RAB11B-AS1表达与患者TNM分期、组织学分级和淋巴结是否转移有关，说明lncRNA RAB11B-AS1可能参与膀胱癌的发生，且影响膀胱癌的发展进程，与上述研究结果一致。有研究指出，RAB11B可通过整合素α5β1激活RCP蛋白，促进细胞迁移［16］。lncRNA RAB11B-AS1也可能通过下调RAB11B表达，抑制膀胱癌细胞增殖、促进膀胱癌细胞凋亡的作用，但其具体作用机制仍有待进一步研究。

冯丽萍等［8］研究发现，lncRNA RAB11B-AS1 在胃癌组织中表达明显高于正常胃组织，且高表达患者中位无进展生存期及总生存期均低于低表达患者，lncRNA RAB11B-AS1是影响胃癌患者预后的独立因素，可能参与调节胃癌的发生发展。本研究中，膀胱癌患者术后5年总生存率为46.99%，lncRNA RAB11BAS1低表达患者5年总生存率低于高表达患者，提示lncRNA RAB11B-AS1低表达的膀胱癌患者预后较差。进一步行多因素Cox回归分析，发现lncRNA RAB11B-AS1低表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素，提示监测lncRNA RAB11B-AS1水平有助于早期准确评估膀胱癌患者预后状况，从而实现早期干预延长生存时间。

综上所述，lncRNA RAB11B-AS1在膀胱癌组织中表达下调，其表达水平与TNM分期、组织学分级和淋巴结是否转移有关，且其低表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素，lncRNA RAB11B-AS1有望成为膀胱癌诊断及预后评估指标。但本研究为单中心回顾性研究，且样本量有限，后续仍需开展前瞻性、多中心、大样本研究加以验证。